Einzelmolekül-FRET-Experimente mit oberflächengebundenen Sonden wurden in der Vergangenheit fast ausschließlich an immobilisierten Molekülen durchgeführt. Viele Biomoleküle diffundieren jedoch und können mit unserer Methode analysiert werden. Die Kombination von Einzelmolekül-FRET mit Tracking ermöglicht es, nicht nur FRET-Mangelzeitspuren von bewegten Sonden zu analysieren, sondern auch raumzeitliche Aspekte wie das Diffusionsverhalten zu untersuchen.
Unsere Methode ist mit einer Vielzahl von verschiedenen FRET-basierten Sonden kompatibel. Zum Beispiel könnte es Einblicke in molekulare Kräfte, Konformationsdynamik und Bindungskinetik in Lebendzellexperimenten liefern. Hochwertige Einzelmolekül-FRET-Experimente sind notorisch schwer durchzuführen.
Für eine zuverlässige Quantifizierung ist es wichtig, Daten mit einem guten Signal-Rausch-Verhältnis und Einzelmolekülspuren von ausreichender Länge aufzuzeichnen. Um mit der Probenmessung zu beginnen, regen Sie die Donor- und Akzeptorfluorophore für eine angemessene Beleuchtungszeit an, während Sie die Kamera auslösen, und warten Sie, bis die Kameraanzeige aktiviert ist. Wiederholen Sie alternativ die Anregung der Donor- und Akzeptorfluorophore.
Wählen Sie die Anzahl der Wiederholungen, die groß genug ist, um das Photobleichen von mindestens einem Fluorophor pro Sonde innerhalb des Sichtfelds sicherzustellen, was eine schrittweise Photobleichanalyse ermöglicht, um Einzelmolekülsignale von Aggregaten zu unterscheiden. Geben Sie die Beleuchtungssequenz an, um die Auswahl von Donor- und Akzeptor-Anregungsrahmen sowie Rahmen für die Bildsegmentierung aus aufgezeichneten Bildsequenzen zu ermöglichen. Analysieren Sie gleichzeitig die Datensätze, die mit den gleichen Beleuchtungseinstellungen aufgezeichnet wurden.
Ordnen Sie dazu jedem Datensatz einen Bezeichner und ein Muster zu, das den jeweiligen Dateinamen der Bildsequenz entspricht. Definieren Sie zusätzlich spezifische Datensätze für spezielle Zwecke, z. B. Aufzeichnungen von Fiducialmarkern für die Bildregistrierung, Anregungslichtprofile für die Flachfeldkorrektur und optional nur Spender- und Akzeptorproben zur Bestimmung von Korrekturfaktoren. Wählen Sie als Nächstes Emissionskanäle und Rohbilder aus, wenn beide Kanäle mit einer einzigen Kamera aufgezeichnet wurden.
Verwenden Sie dazu das entsprechende grafische Widget, um geeignete Regionen für die Spender- und Akzeptoremission auszuwählen, dann Fiducialmarker in beiden Emissionskanälen zu lokalisieren und die Bildregistrierung durchzuführen. Verwenden Sie die bereitgestellte Benutzeroberfläche, um die geeigneten Parameter für den Lokalisierungsalgorithmus für Donor- und Akzeptor-Emissionskanäle zu finden. Als nächstes legen Sie Einzelmolekül-Lokalisierungsparameter für FRET-Sonden bei Donoranregung in der Summe der Bilder fest, die aus Donor- und Akzeptoremissionen erhalten wurden, und legen Sie dann Lokalisierungsparameter für Sonden bei Akzeptoranregung im Akzeptoremissionskanal fest.
Lokalisieren Sie die FRET-Sonden bei Donor- und Akzeptoranregung unabhängig voneinander in allen Frames. Die Ergebnisse werden in einer Tabelle zusammengeführt, die die ursprüngliche Rahmennummer, zweidimensionale Koordinaten und einen Bezeichner enthält, der sich auf die Quellbilddatei bezieht. Um die Fluoreszenzintensität zu verfolgen und zu messen, wählen Sie geeignete Optionen für den Trackpy-Algorithmus aus, um FRET-Sondenlokalisationen mit Trajektorien zu verknüpfen.
Als nächstes verarbeiten Sie mithilfe der Analysesoftware-Funktionalität zusätzliche Bilddaten aus Bildsequenzen. Extrahieren Sie zusätzliche Bilder, die aufgezeichnet wurden, um die durch S markierte Segmentierung in der Anregungssequenz zu erleichtern. Bestimmen Sie schließlich die Anregungslichtprofile von Donor und Akzeptor über das Sichtfeld aus Bildern, die auf einer dicht markierten Probe aufgezeichnet wurden.
Für die ersten Filterschritte werden Rückwurfsignale mit überlappenden Punktspreizfunktionen verworfen, da es schwierig ist, ihre Fluoreszenzintensitäten zuverlässig zu bestimmen. Akzeptieren Sie bei inhomogener Beleuchtung nur Signale, die sich in gut beleuchteten Bereichen innerhalb des Sichtfelds befinden, um ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis zu gewährleisten. Wenn Sie intramolekulare FRET untersuchen, beschränken Sie die Analyse auf die Trajektorien, die seit Beginn der Bildsequenz vorhanden sind.
Führen Sie als Nächstes die Flachfeldkorrektur aus, die die zuvor erhaltenen Anregungslichtquellenprofile verwendet, um die positionsabhängigen Fluoreszenzintensitätsschwankungen umzukehren, die durch inhomogene Beleuchtung verursacht werden, und berechnen Sie dann die scheinbare FRET-Effizienz und die scheinbare Stöchiometrie. Um eine schrittweise Analyse der Photobleichung zur Unterscheidung zwischen einzelnen molekularen Sonden und Aggregaten durchzuführen, finden Sie geeignete Parameter für den Änderungspunkterkennungsalgorithmus bei Donor- und Akzeptoranregung unabhängig voneinander. Führen Sie dann den Änderungspunkterkennungsalgorithmus aus.
Um spurenloses Photobleichverhalten zu entfernen, definieren Sie Intensitätsschwellenwerte, unterhalb derer ein Fluorophor als gebleicht gilt, und wählen Sie dann eine der folgenden Optionen aus. Option eins, bei der der Akzeptor Fluorophor in einem einzigen Schritt bleiicht, während der Spender keine partielle Bleiche zeigt. Option zwei, bei der der Spender in einem einzigen Schritt bleiicht, während es keine partielle Akzeptorbleiche gibt.
Option drei, wobei entweder Fluorophor in einem einzigen Schritt bleicht, während der andere nicht teilweise bleicht. Und Option vier, bei der Donor- und Akzeptorfluorophore einstufiges Photobleichen oder gar kein Photobleichen zeigen. Berechnen Sie dann die Korrekturfaktoren für die Donoremissionsleckage in den Akzeptorkanal, die direkte Akzeptoranregung, die Detektionseffizienz und die Anregungseffizienzen.
Verwenden Sie als Nächstes die Korrekturfaktoren, um die FRET-Effizienz aus der scheinbaren Effizienz und die Stöchiometrie aus der scheinbaren Stöchiometrie zu berechnen. Wählen Sie zur weiteren Filterung nur Datenpunkte vor dem ersten Bleichereignis in jeder Leitkurve aus. Um die Analyse auf Einzelmolekülsonden zu beschränken, akzeptieren Sie außerdem nur Trajektorien mit mindestens 75% der Datenpunkte innerhalb der entsprechenden Stöchiometriegrenzen.
Führen Sie dann eine Bildsegmentierung über globale oder adaptive Schwellenwertmethoden für die entsprechenden Hilfsbilder durch, um die Analyse auf verschiedene Bereiche innerhalb des Sichtfelds zu beschränken. Erstellen Sie Effizienz- und Stöchiometriediagramme, um sicherzustellen, dass Signale falscher Stöchiometrie korrekt identifiziert und entfernt wurden. Zeichnen Sie dann Histogramme der FRET-Effizienzen auf, um einen fundierten Überblick über die FRET-Effizienzverteilungen zu erhalten, und gruppieren Sie die Histogramme für einen bequemen Vergleich der Ergebnisse aus verschiedenen Experimenten.
Mit wissenschaftlichen Python-Bibliotheken ist es möglich, die Daten innerhalb des Notebooks weiter auszuwerten und beispielsweise Diffusionsanalysen durchzuführen. Die Visualisierung und Verfolgung des Einzelmolekül-FRET-Ereignisses wird hier gezeigt. Gefilterte FRET-Ereignisse werden durch Effizienz- und Stöchiometriediagramme in einem FRET-Effizienzhistogramm dargestellt.
Darüber hinaus können Mobilitätsparameter untersucht werden, indem ein einzelner Trajektorienpfad in einem XY-Diagramm oder einem mittleren quadratischen Verschiebungsdiagramm dargestellt wird. Das Ergebnis unserer Plattform ermöglicht es uns, Übergänge in FRET-Effizienzzeitspuren mobiler Sonden weiter zu identifizieren. Zum Beispiel, um Konformationsänderungen der Biomoleküle zu bewerten.
Mit einem FRET-basierten Kraftsensor ermöglichte uns die Analyseplattform, Einzelmolekül-Kraftereignisse innerhalb der immunologischen Synapse während der frühen T-Zell-Signalisierung zu quantifizieren.
