تم إجراء تجارب FRET أحادية الجزيء باستخدام مجسات سطحية بشكل حصري تقريبا على الجزيئات المجمدة في الماضي. ومع ذلك ، تنتشر العديد من الجزيئات الحيوية ويمكن تحليلها باستخدام طريقتنا. إن الجمع بين FRET أحادي الجزيء والتتبع يجعل من الممكن تحليل ليس فقط آثار وقت نقص FRET للمجسات المتحركة ، ولكن أيضا للتحقيق في الجوانب المكانية الزمانية مثل السلوك المنتشر.
طريقتنا متوافقة مع مجموعة متنوعة من المجسات المختلفة القائمة على FRET. على سبيل المثال ، يمكن أن يوفر رؤى بشأن القوى الجزيئية ، والديناميكيات التوافقية ، والحركيات الملزمة في تجارب الخلايا الحية. من الصعب إجراء تجارب FRET أحادية الجزيء عالية الجودة.
من أجل تحديد كمي موثوق به ، من المهم تسجيل البيانات بنسبة إشارة إلى ضوضاء جيدة ومسارات أحادية الجزيء بطول كاف. لبدء قياس العينة، قم بإثارة الفلوروفورات المانحة والمتقبلة للحصول على وقت إضاءة مناسب أثناء تشغيل الكاميرا وانتظر حتى يتم تمكين قراءة الكاميرا. كرر إثارة الفلوروفورات المانحة والمتقبلة بدلا من ذلك.
اختر عدد التكرارات لتكون كبيرة بما يكفي لضمان التبييض الضوئي لفلوروفور واحد على الأقل لكل مسبار داخل مجال الرؤية مما يسمح لتحليل التبييض الضوئي التدريجي بالتمييز بين إشارات الجزيء الواحد من المجاميع. حدد تسلسل الإضاءة للسماح بتحديد إطارات الإثارة المانحة والمتقبلة وكذلك إطارات تجزئة الصورة من تسلسلات الصور المسجلة. في الوقت نفسه ، قم بتحليل مجموعات البيانات المسجلة باستخدام نفس إعدادات الإضاءة.
تحقيقا لهذه الغاية، قم بتعيين معرف ونمط يطابق أسماء ملفات تسلسل الصور المعنية لكل مجموعة بيانات. بالإضافة إلى ذلك، حدد مجموعات بيانات محددة لأغراض خاصة مثل تسجيلات العلامات الائتمانية لتسجيل الصور، وملفات تعريف ضوء الإثارة لتصحيح الحقل المسطح، وعينات اختيارية للمتبرعين فقط والمقبولين فقط لتحديد عوامل التصحيح. بعد ذلك، حدد قنوات الانبعاثات والصور الخام إذا تم تسجيل كلتا القناتين باستخدام كاميرا واحدة.
لهذا ، استخدم الأداة الرسومية المناسبة لتحديد المناطق المناسبة لانبعاثات المانحين والمستقبلين ، ثم قم بتوطين العلامات الائتمانية في كل من قنوات الانبعاثات وإجراء تسجيل الصور. استخدم واجهة المستخدم المتوفرة للعثور على المعلمات المناسبة لخوارزمية التعريب لكل من قنوات الانبعاثات المانحة والمستقبلة. بعد ذلك ، قم بتعيين معلمات توطين جزيء واحد لمجسات FRET عند إثارة المتبرع في مجموع الصور التي تم الحصول عليها من انبعاثات المتبرع والمتقبل ، ثم قم بتعيين معلمات التوطين للمجسات عند إثارة المتلقي في قناة انبعاث المستقبل.
توطين مجسات FRET عند إثارة المتبرع والمتقبل بشكل مستقل في جميع الإطارات. يتم دمج النتائج في جدول واحد يحتوي على رقم الإطار الأصلي والإحداثيات ثنائية الأبعاد والمعرف الذي يشير إلى ملف الصورة المصدر. لتتبع وقياس شدة التألق ، اختر الخيارات المناسبة لخوارزمية Trackpy لربط توطينات مسبار FRET بالمسارات.
بعد ذلك ، باستخدام وظيفة برنامج التحليل ، قم بمعالجة بيانات الصور الإضافية من تسلسل الصور. استخراج صور إضافية مسجلة لتسهيل التجزئة المميزة بحرف S في تسلسل الإثارة. وأخيرا، حدد ملفات تعريف ضوء الإثارة المانحة والمتقبلة عبر مجال الرؤية من الصور المسجلة على عينة ذات علامات كثيفة.
بالنسبة لخطوات التصفية الأولية ، تجاهل الإشارات ذات وظائف انتشار النقطة المتداخلة لأنه من الصعب تحديد شدتها الفلورية بشكل موثوق. في حالة الإضاءة غير المتجانسة، لا تقبل سوى الإشارات الموجودة في المناطق المضاءة جيدا داخل مجال الرؤية لضمان نسبة إشارة إلى ضوضاء جيدة. إذا كنت تدرس FRET داخل الجزيئات ، فقم بتقييد التحليل على تلك المسارات الموجودة منذ بداية تسلسل الصورة.
بعد ذلك ، قم بتنفيذ تصحيح المجال المسطح ، والذي يستخدم ملفات تعريف مصدر ضوء الإثارة التي تم الحصول عليها في وقت سابق لعكس اختلافات شدة التألق المعتمدة على الموضع الناجمة عن الإضاءة غير المتجانسة ، ثم حساب كفاءة FRET الظاهرة وقياس stoichiometry الظاهر. لإجراء تحليل تدريجي للتبييض الضوئي للتمييز بين المجسات الجزيئية المفردة والمجاميع ، ابحث عن المعلمات المناسبة لخوارزمية اكتشاف نقطة التغيير عند إثارة المتبرع والمستقبل بشكل مستقل. ثم قم بتنفيذ خوارزمية اكتشاف نقطة التغيير.
لإزالة المسار الذي يظهر سلوك التبييض الضوئي الغامض، حدد عتبات الكثافة التي يعتبر الفلوروفور تحتها مبيضا، ثم حدد أحد الخيارات التالية. الخيار الأول حيث يبيض الفلوروفور المتقبل في خطوة واحدة بينما لا يظهر المتبرع أي تبييض جزئي. الخيار الثاني حيث يقوم المتبرع بالتبييض في خطوة واحدة بينما لا يوجد تبييض جزئي للمتقبل.
الخيار الثالث حيث يقوم أي من المبيضات الفلوروفورية في خطوة واحدة بينما لا تبيض الأخرى جزئيا. والخيار الرابع حيث تظهر الفلوروفورات المانحة والمتقبلة تبييض ضوئي أحادي الخطوة أو لا يوجد تبييض ضوئي على الإطلاق. ثم احسب عوامل التصحيح لتسرب انبعاثات المانحين إلى قناة المستقبل، وإثارة المتقبل المباشر، وكفاءة الكشف وكفاءة الإثارة.
بعد ذلك ، استخدم عوامل التصحيح لحساب كفاءة FRET من الكفاءة الظاهرة وقياس stoichiometry من stoichiometry الظاهر. لمزيد من التصفية، حدد نقاط البيانات فقط من قبل حدث التبييض الأول في كل مسار. بالإضافة إلى ذلك ، لتقييد التحليل على مجسات أحادية الجزيء ، تقبل فقط المسارات التي تحتوي على 75٪ على الأقل من نقاط البيانات ضمن حدود stoichiometry المناسبة.
ثم قم بإجراء تجزئة الصورة عبر طرق العتبة العالمية أو التكيفية على الصور المساعدة المناسبة لتقييد التحليل إلى مناطق متميزة داخل مجال الرؤية. إنشاء مخططات الكفاءة مقابل قياس الستويشيومتري للتحقق من أن إشارات قياس الستويشيومتري غير الصحيحة قد تم تحديدها وإزالتها بشكل صحيح. ثم قم برسم المدرج التكراري لكفاءات FRET لتوفير نظرة عامة راسخة على توزيعات كفاءة FRET وتجميع المدرج التكراري للمقارنة المريحة للنتائج من التجارب المختلفة.
من خلال الاستفادة من مكتبات Python العلمية ، من الممكن إجراء مزيد من التقييم للبيانات داخل دفتر الملاحظات ، وإجراء ، على سبيل المثال ، تحليل الانتشار. يتم عرض تصور وتتبع حدث FRET أحادي الجزيء هنا. يتم تمثيل أحداث FRET التي تمت تصفيتها من خلال مخططات الكفاءة مقابل stoichiometry في الرسم البياني لكفاءة FRET.
علاوة على ذلك ، يمكن التحقيق في معلمات التنقل عن طريق رسم مسار مسار فردي في مخطط XY أو مخطط إزاحة مربع متوسط. يسمح لنا مخرجات منصتنا بتحديد التحولات بشكل أكبر في آثار وقت كفاءة FRET للمجسات المتنقلة. على سبيل المثال ، لتقييم التغيرات التوافقية للجزيئات الحيوية.
باستخدام مستشعر قوة قائم على FRET ، سمحت لنا منصة التحليل بتحديد أحداث قوة الجزيء الواحد داخل المشبك المناعي أثناء إشارات الخلايا التائية المبكرة.
