对免疫突触输出的研究主要局限于微观方法。BSLB扩展了我们可用于研究T细胞免疫突触输出的工具库，包括流式细胞术，显微镜检查，蛋白质组学和RNA测序技术。因此，BSLB可用于各种免疫学问题以及鉴定T细胞输出的组成和生化调节。
例如，这包括研究嵌合抗原受体，抑制特定信号通路的药物或目标基因的遗传消融。该协议最关键的方面之一是优化蛋白质校准和跟踪目标跨突触颗粒所需的多色流式细胞术面板。这需要蛋白质浓度、抗体浓度和仪器设置的系统迭代。
首先用1， 000微升PBS稀释一微升珠溶液。使用血细胞计数器室计数珠子并计算其每毫升浓度。然后，计算每个滴定点500， 000个最终BSLB所需的硅微珠体积。
将所需体积的硅微珠转移到无菌的1.5毫升微量离心管中。用一毫升无菌PBS洗涤硅珠三次，然后离心微珠。制备三体积的脂质体预混液，其中含有最终12.5摩尔%的含镍磷脂。
使用脂质体预混液重悬洗涤的二氧化硅珠。然后，通过上下移液总体积的一半来轻轻混合。使用无菌技术，向管中加入氩气或氮气以置换空气并保护脂质在混合过程中免受氧化。
将氩气添加到0.4毫摩尔脂质储备中。储存库存并使用无菌技术进行操作。将BSLB移至垂直混合器，并在室温下使用10 RPM的轨道混合混合30分钟。
然后，通过在台式小型离心机上在室温下离心15秒来旋转珠子。通过加入一毫升含有100微摩尔硫酸镍的5%BSA来阻断形成的BSLBs，以使BSLBs上的NTA位点饱和。
取新的U型底或V型底96孔板并制备蛋白质的两倍连续稀释液。将制备的BSLBs重悬在体积中，使得100微升HBS-HSA缓冲液含有500，000个BSLBs。然后，取另一个U型底或V型底96孔板，并将100微升的BSLB悬浮液转移到孔中，以使每个孔接收500， 000个BSBL。
在室温下以300x G离心第二块板两分钟.丢弃上清液并将100微升体积从蛋白质滴定板转移到含有沉淀BSLB的板中。轻轻混合，避免在移液时产生过多的气泡。使用铝箔保护其免受光照，并在室温下以1， 000 RPM孵育30分钟。
然后，通过将HBS-HSA缓冲液加入板中洗涤板三次，并在室温下以300x G旋转两分钟。洗涤后计数细胞。然后，使用突触转移测定培养基将它们稀释至每毫升250万的最终浓度。一旦BSLBs加载了蛋白质混合物，用HBS-HSA缓冲液洗涤BSLBs两次以除去多余的未结合蛋白质。
将每孔500， 000 BSLBs重悬于200微升HBS-HSA缓冲液中。将每孔100微升BSLB转移到新的U-bottom 96孔板中以复制，使得每孔BSLB的最终量为250，000。在室温下以300x G旋转BSLB两分钟。
弃去上清液，然后使用100微升T细胞悬浮液重悬BSLBs。轻轻混合以防止形成气泡。在37摄氏度下孵育共培养物90分钟。
保护细胞免受光照，并通过首先在室温下孵育至少15分钟来冷却共培养物。在室温下以500x G离心共培养物5分钟，弃去上清液，并将共培养物在室温下重悬于不含钙和镁离子的2%BSA PBS中以进行封闭。将细胞放在冰上45分钟，并保护它们免受光照。
使用冰冷的0.22微米过滤的2%BSA和PBS作为染色缓冲液制备抗体预混液。此预混液将提供额外的阻塞。在500x G下旋转共培养物5分钟和4摄氏度。
弃去上清液，然后使用多通道移液管将细胞重悬于含有优化抗体浓度的染色预混液中。包括同种型标记的细胞和BSLBs，荧光和非荧光BSLBs，以及单独染色的细胞和BSLBs。通过上下移液一半体积轻轻混合。
在冰上孵育30分钟，并保护它们免受光照。使用冰冷的2%BSA PBS洗涤细胞和BSLBs两次。在4摄氏度下以500x G旋转五分钟。
离心后，检查孔底部沉淀的共培养物。然后，将洗涤的共培养物重悬于100微升PBS中并立即获得。激活侧向散射光的对数刻度，激活侧向和前向散射光的飞行时间参数。
获取MESF标准，确保暗集和最亮的人群都落在仪器的线性范围内。然后，获取补偿样本，计算补偿，并将补偿矩阵应用于实验。为每个定量通道采集并保存至少 20， 000 个 MESF 标准品。
避免使用FACS鞘液或类似重悬MESF微球，因为这些含有会破坏荧光染料的盐和醇，导致更宽的荧光峰和高误差。对于使用高通量采样器的采集，请将仪器采集设置为标准，将样本采集设置为80微升。样品流速在每秒2到3微升之间，样品混合体积为50微升，样品混合为每秒150微升，每孔混合在3到5之间。
每个样品至少采集 10， 000 个单 BSLB。最后，导出 FCS 文件。这里显示了ICAM-1在扁桃体B细胞和辅助T细胞表面的定量流式细胞术测量的示例。
代表性图像描述了用于分析从人腭扁桃体中分离的单个CXCR5 B细胞和滤泡辅助T细胞的门控策略。这种顺序门控策略可识别连续采集窗口中的单个实时事件。此处显示了二元组，即与FMO对照和标有群体相关同种型的FMO对照相比，ICAM-1的细胞表面表达。
此处显示了 MESF 群体叠加直方图中来自不同标准 MESF 群体的 MFI 的门控和测量。这些值表示五个 MESF 群体中每个群体的小额信贷机构。本文介绍了MESF群体MESF相对于cMFI的线性回归。
斜率从TFH扁桃体B细胞表面的ICAM-1的FCM数据中提取与细胞结合的MESF。转换为绝对分子密度遵循这些简单的数学运算。代表性图像显示了重组单体ICAM-1 12组氨酸密度增加的BSLBs的流式细胞术分析。
此处显示了ICAM-1参考浓度相对于测量密度的回归分析。斜率用于计算蛋白质的目标浓度，以达到细胞的密度。流程图显示了与BSLBs共培养T细胞的关键步骤，在随后使用流式细胞术测量颗粒转移时重建模型膜。
此处显示了在连续采集窗口中识别单个BSLB和细胞的门控策略。该协议最重要的方面之一是，为了保持结果的可重复性，每次更换蛋白质或脂质储备时，都需要执行新的校准分析。为了发现由不同T细胞亚群分泌的新的有效分子，BSLBs可以通过荧光激活的细胞分选进一步分离，以进行转录组学和蛋白质组学分析。
我们在牛津大学的同事已经使用这项技术来研究和证明新的受体 - 配体相互作用，并研究遗传消融对T细胞免疫突触输出的影响。
