L’étude de la sortie de la synapse immunitaire a été limitée principalement à des méthodes microscopiques. Les BSLB ont élargi notre répertoire d’outils pouvant être utilisés pour étudier la production de synapses immunitaires des lymphocytes T, y compris la cytométrie en flux, la microscopie, la protéomique et les technologies de séquençage de l’ARN. En tant que tels, les BSLB peuvent être utilisés dans une grande variété de questions d’immunologie et dans l’identification de la composition et de la régulation biochimique de la sortie des lymphocytes T.
Cela inclut, par exemple, l’étude des récepteurs d’antigènes chimériques, des médicaments qui inhibent des voies de signalisation spécifiques ou l’ablation génétique de gènes d’intérêt. L’un des aspects les plus critiques de ce protocole est d’optimiser les étalonnages de protéines et le panel de cytométrie en flux multicolore requis pour suivre la particule transsynaptique d’intérêt. Cela nécessite l’itération systématique des concentrations de protéines, des concentrations d’anticorps et des paramètres de l’instrument.
Commencez par diluer un microlitre de solution de billes avec 1 000 microlitres de PBS. Comptez les billes à l’aide d’une chambre hémocytométrique et calculez leur concentration par millilitre. Ensuite, calculez le volume de billes de silice nécessaire pour 500 000 BSLB finaux par point de titrage.
Transférer le volume requis de billes de silice dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 millilitre. Lavez les billes de silice trois fois avec un millilitre de PBS stérile et centrifugez les billes. Préparez trois volumes de mélange maître de liposomes contenant un pourcentage final de 12,5 moles de phospholipides contenant du nickel.
Utilisez le mélange maître de liposomes pour remettre en suspension les billes de silice lavées. Ensuite, mélangez-le doucement en pipetant de haut en bas la moitié du volume total. À l’aide d’une technique stérile, ajoutez de l’argon ou de l’azote gazeux au tube pour déplacer l’air et protéger les lipides de l’oxydation pendant le mélange.
Ajouter de l’argon aux stocks lipidiques de 0,4 millimolaire. Stockez le stock et manipulez-le à l’aide d’une technique stérile. Déplacez les BSLB vers le mélangeur vertical et mélangez pendant 30 minutes à température ambiante en utilisant le mélange orbital à 10 tr / min.
Ensuite, faites tourner les perles en centrifugant pendant 15 secondes à température ambiante sur une minicentrifugeuse de paillasse. Bloquer les BSLEB formés en ajoutant un millilitre de 5% de BSA contenant 100 micromolaires de sulfate de nickel pour saturer les sites NTA sur les BSLB. Laver trois fois à l’aide d’un tampon HBS-HSA pour éliminer l’excès de solution bloquante.
Prenez une nouvelle plaque de 96 puits à fond en U ou à fond en V et préparez deux dilutions en série des protéines. Remettre en suspension les BSLEB préparés dans un volume tel que 100 microlitres de tampon HBS-HSA contiennent 500 000 BSLEB. Ensuite, prenez une autre plaque de 96 puits à fond en U ou à fond en V et transférez 100 microlitres de la suspension BSLB aux puits de manière à ce que chaque puits reçoive 500 000 BSEL.
Faire tourner la deuxième plaque à température ambiante pendant deux minutes à 300x G.Jeter le surnageant et transférer des volumes de 100 microlitres de la plaque de titrage des protéines vers la plaque contenant les BSLB sédimentés. Mélanger doucement, en évitant la génération excessive de bulles lors du pipetage. Utilisez du papier d’aluminium pour le protéger de la lumière et incubé à température ambiante pendant 30 minutes à 1 000 tr / min.
Ensuite, lavez la plaque trois fois en ajoutant un tampon HBS-HSA à la plaque et faites-la tourner à température ambiante pendant deux minutes à 300x G.Comptez les cellules après le lavage. Ensuite, diluez-les à une concentration finale de 2,5 millions par millilitre à l’aide d’un milieu de dosage de transfert synaptique. Une fois que les BSLEB sont chargés avec le mélange de protéines, lavez les BSLB deux fois avec un tampon HBS-HSA pour éliminer l’excès de protéines non liées.
Remettre en suspension 500 000 BSLB par puits dans 200 microlitres de tampon HBS-HSA. Transférer 100 microlitres de BSLB par puits vers une nouvelle plaque de 96 puits à fond en U pour en faire un double, de sorte que la quantité finale de BSLB par puits soit de 250 000. Faites tourner les BSLB à 300x G pendant deux minutes à température ambiante.
Jetez le surnageant, puis remettez en suspension les BSLEB à l’aide de 100 microlitres de suspension de lymphocytes T. Mélanger doucement pour éviter la formation de bulles. Incuber les co-cultures pendant 90 minutes à 37 degrés Celsius.
Protégez les cellules de la lumière et refroidissez les co-cultures en les incubant d’abord à température ambiante pendant au moins 15 minutes. Centrifuger les co-cultures à température ambiante pendant cinq minutes à 500x G.Jeter le surnageant et remettre en suspension les co-cultures dans du CALCIUM et du magnésium sans 2% BSA PBS à température ambiante pour les bloquer. Placez les cellules sur la glace pendant 45 minutes et protégez-les de la lumière.
Préparez le mélange maître d’anticorps en utilisant du BSA et du PBS filtrés à 0,22 micromètre et du PBS comme tampon de coloration. Ce mélange principal fournira un blocage supplémentaire. Faites tourner les co-cultures à 500x G pendant cinq minutes et quatre degrés Celsius.
Jetez les surnageants, puis utilisez une pipette multicanal pour remettre en suspension les cellules dans le mélange maître de coloration contenant des concentrations d’anticorps optimisées. Inclure les cellules marquées par isotype et les BSLECB, les BSLB fluorescents et non fluorescents, ainsi que les cellules et les BSLB colorés seuls. Mélanger doucement en pipetant vers le haut et vers le bas la moitié du volume.
Incuber pendant 30 minutes sur de la glace et les protéger de la lumière. Lavez les cellules et les BSLEB deux fois à l’aide de PBS 2% BSA glacé. Faites-les tourner à 500x G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Après centrifugation, vérifier la co-culture sédimentée au fond des puits. Ensuite, remettez en suspension les co-cultures lavées dans 100 microlitres de PBS et acquérez-les immédiatement. Activez l’échelle logarithmique pour la lumière diffusée latéralement et le paramètre de temps de vol pour les lumières diffusées latéralement et vers l’avant.
Acquérir les normes MESF, en veillant à ce que les populations les plus sombres et les plus brillantes se situent dans la gamme linéaire de l’instrument. Ensuite, acquérez des échantillons de compensation, calculez la compensation et appliquez la matrice de compensation à l’expérience. Acquérir et enregistrer un minimum de 20 000 normes MESF au total pour chaque canal de quantification.
Évitez d’utiliser du liquide de gaine FACS ou similaire pour remettre en suspension des billes MESF, car celles-ci contiennent des sels et des alcools qui détruiront les fluorochromes, entraînant des pics de fluorescence plus larges et une erreur élevée. Pour l’acquisition à l’aide d’échantillonneurs à haut débit, réglez l’acquisition d’instruments sur Standard, réglez l’acquisition d’échantillons sur 80 microlitres. Débit de l’échantillon entre deux et trois microlitres par seconde, volume de mélange de l’échantillon à 50 microlitres, mélange de l’échantillon de 150 microlitres par seconde et mélange par puits entre trois et cinq.
Acquérir un minimum de 10 000 BSLB uniques par échantillon. Enfin, exportez les fichiers FCS. Un exemple de mesures quantitatives de cytométrie en flux de l’ICAM-1 à la surface des lymphocytes B amygdaliens et des lymphocytes T auxiliaires est présenté ici.
Les images représentatives décrivent la stratégie de contrôle pour l’analyse des lymphocytes B CXCR5 uniques et des lymphocytes T folliculaires auxiliaires isolés des amygdales palatines humaines. Cette stratégie de contrôle séquentiel identifie des événements en direct uniques dans la fenêtre d’acquisition continue. Les doublets, l’expression de la surface cellulaire de l’ICAM-1 par rapport aux contrôles FMO et aux contrôles FMO étiquetés avec les isotypes pertinents des populations, sont montrés ici.
La vérification et la mesure des IMF de différentes populations MESF standard dans les histogrammes superposés des populations MESF sont présentées ici. Les valeurs représentent les IMF pour chacune des cinq populations MESF. La régression linéaire du MESF sur l’IFM pour les populations du MESF est présentée ici.
La pente extrait mesF lié aux cellules à partir des données FCM de l’ICAM-1 à la surface des cellules B amygdales dans TFH. La conversion en densités moléculaires absolues suit ces opérations mathématiques simples. Les images représentatives montrent l’analyse par cytométrie en flux des BSLEB reconstitués avec des densités accrues d’histidines monomères recombinantes ICAM-1 12.
Les analyses de régression de la concentration de référence ICAM-1 par rapport à la densité mesurée sont présentées ici. La pente est utilisée pour calculer les concentrations cibles de protéines afin d’atteindre la densité des cellules. Les diagrammes de flux montrent les étapes critiques pour la co-culture des lymphocytes T avec les BSLB, la reconstitution des membranes modèles dans la mesure ultérieure du transfert de particules avec cytométrie en flux.
La stratégie de contrôle pour identifier les BSLB et les cellules uniques dans la fenêtre d’acquisition continue est présentée ici. L’un des aspects les plus importants de ce protocole est que, pour maintenir la reproductibilité des résultats, chaque fois que vous modifiez les stocks de protéines ou de lipides, vous devez effectuer une nouvelle analyse d’étalonnage. Pour découvrir de nouvelles molécules efficaces sécrétées par différents sous-ensembles de lymphocytes T, les BSLB peuvent être isolés davantage par tri cellulaire activé par fluorescence soumis à une analyse transcriptomique et protéomique.
Nos collègues de l’Université d’Oxford ont utilisé cette technologie pour étudier et démontrer de nouvelles interactions récepteur-ligand, ainsi que pour étudier les effets des ablations génétiques sur la sortie de la synapse immunitaire des lymphocytes T.
