Изучение выхода иммунного синапса было ограничено в основном микроскопическими методами. BSLB расширили наш репертуар инструментов, которые могут быть использованы для изучения выхода иммунных синапсов Т-клеток, включая проточную цитометрию, микроскопию, протеомику и технологии секвенирования РНК. Таким образом, BSLB могут быть использованы в широком спектре вопросов иммунологии и в определении состава и биохимической регуляции выхода Т-клеток.
Это включает, например, изучение химерных антигенных рецепторов, препаратов, которые ингибируют специфические сигнальные пути, или генетическую абляцию генов, представляющих интерес. Одним из наиболее важных аспектов этого протокола является оптимизация калибровки белка и многоцветной проточной цитометрической панели, необходимой для отслеживания транссинаптических частиц, представляющих интерес. Это требует систематической итерации концентраций белка, концентраций антител и настроек приборов.
Начните с разбавления одного микролитра бисерного раствора 1000 микролитрами PBS. Подсчитайте бусины с помощью камеры гемоцитометра и рассчитайте их концентрацию на миллилитр. Затем рассчитайте объем кварцевых шариков, необходимый для 500 000 конечных BSLB на точку титрования.
Перенесите необходимый объем шариков кремнезема в стерильную 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку. Трижды вымойте кварцевые шарики одним миллилитром стерильного PBS и центрифугируйте бусины. Приготовьте три тома липосомной мастер-смеси, содержащей конечные 12,5-моль процента никельсодержащих фосфолипидов.
Используйте смесь липосом для повторного суспендирования промытых кварцевых шариков. Затем аккуратно перемешайте его, пипетируя вверх и вниз половину общего объема. Используя стерильный метод, добавьте газообразный аргон или азот в трубку, чтобы вытеснить воздух и защитить липиды от окисления во время смешивания.
Добавьте аргон к 0,4-миллимолярным липидным запасам. Храните запасы и манипулируйте ими, используя стерильную технику. Переместите BSLB в вертикальный смеситель и перемешивайте в течение 30 минут при комнатной температуре, используя орбитальное перемешивание при 10 оборотах в минуту.
Затем раскрутите шарики центрифугированием в течение 15 секунд при комнатной температуре на настольной мини-центрифуге. Блокируют образующиеся BSLB путем добавления одного миллилитра 5% BSA, содержащего 100-микромоляр сульфата никеля, для насыщения NTA-сайтов на BSLB. Промыть три раза с использованием буфера HBS-HSA для удаления избыточного блокирующего раствора.
Возьмите новую U-образную или V-нижнюю 96-луночную пластину и приготовьте двукратное серийное разведение белков. Повторно суспендируют подготовленные BSLB в объеме таким образом, чтобы 100 микролитров буфера HBS-HSA содержали 500 000 BSLB. Затем возьмите еще одну U-образную или V-донную 96-луночную пластину и перенесите 100 микролитров подвески BSLB в скважины таким образом, чтобы каждая скважина получала 500 000 BSBL.
Открутите вторую пластину при комнатной температуре в течение двух минут при 300x G. Отбросьте супернатант и перенесите 100-микролитровые объемы с пластины титрования белка на пластину, содержащую осажденные BSLB. Осторожно перемешайте, избегая образования избыточных пузырьков при пипетке. Используйте алюминиевую фольгу для защиты от света и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут при 1000 оборотах в минуту.
Затем вымойте пластину три раза, добавив буфер HBS-HSA к пластине, и открутите ее при комнатной температуре в течение двух минут при 300x G. Подсчитайте ячейки после промывки. Затем разбавляют их до конечной концентрации 2,5 миллиона на миллилитр с помощью синаптической переносной пробирной среды. После того, как BSLB будут загружены белковой смесью, дважды промыть BSLB буфером HBS-HSA, чтобы удалить лишние несвязанные белки.
Повторное суспендирование 500 000 BSLB на скважину в 200 микролитрах буфера HBS-HSA. Перенесите 100 микролитров BSLB на скважину на новую U-образную 96-луночную пластину, чтобы сделать дубликат, так что конечное количество BSLB на скважину составляет 250 000. Открутите BSLB при 300x G в течение двух минут при комнатной температуре.
Отбросьте супернатант, а затем повторно суспендируйте BSLB, используя 100 микролитров суспензии Т-клеток. Осторожно перемешайте, чтобы предотвратить образование пузырьков. Инкубируйте кокультуры в течение 90 минут при температуре 37 градусов Цельсия.
Защитите клетки от света и охладите сокультуры, предварительно инкубируя их при комнатной температуре в течение минимум 15 минут. Центрифугируйте кокультуры при комнатной температуре в течение пяти минут при 500x G.Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте кокультуры в 2% BSA PBS без ионов кальция и магния при комнатной температуре для блокировки. Поместите клетки на лед на 45 минут и защитите их от света.
Приготовьте смесь антител с использованием ледяного 0,22-микрометрового фильтрованного 2% BSA и PBS в качестве буфера окрашивания. Этот мастер-микс обеспечит дополнительную блокировку. Вращайте со-культуры при 500x G в течение пяти минут и четырех градусов цельсия.
Отбросьте супернатанты, а затем используйте многоканальную пипетку для повторного суспендирования клеток в мастер-смеси окрашивания, содержащей оптимизированные концентрации антител. Включают изотип-меченые клетки и BSLB, флуоресцентные и нефлуоресцентные BSLB, а также клетки и BSLB, окрашенные отдельно. Осторожно перемешайте, пипетируя вверх и вниз половину объема.
Насиживайте в течение 30 минут на льду и защищайте их от света. Промывайте ячейки и BSLB дважды, используя ледяной 2% BSA PBS. Вращайте их вниз при 500x G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.
После центрифугирования проверьте кокультуру, отложенную на дне скважин. Затем повторно суспендируют промытые кокультуры в 100 микролитрах PBS и сразу же приобретают. Активируйте шкалу журнала для бокового рассеянного света и параметр времени пролета для боковых и передних рассеянных огней.
Приобретите стандарты MESF, гарантируя, что как тусклые, так и самые яркие популяции попадают в линейный диапазон прибора. Затем приобретите компенсационные образцы, рассчитайте компенсацию и примените матрицу компенсации к эксперименту. Приобретите и сохраните не менее 20 000 стандартов MESF для каждого канала количественной оценки.
Избегайте использования жидкости FACS или аналогичных бусинам MESF, так как они содержат соли и спирты, которые разрушают флуорохромы, что приводит к более широким пикам флуоресценции и высокой погрешности. Для сбора с использованием высокопроизводительных пробоотборников установите для сбора приборов значение Standard, установите отбор проб на 80 микролитров. Расход пробы от двух до трех микролитров в секунду, объем смешивания образца при 50 микролитрах, смешивание образцов 150 микролитров в секунду и смешивание на скважину от трех до пяти.
Приобретите не менее 10 000 одиночных BSLB на образец. Наконец, экспортируйте файлы FCS. Приведен пример количественных измерений проточной цитометрии ICAM-1 на поверхности тонзиллярных В-клеток и хелперных Т-клеток.
Репрезентативные изображения описывают стратегию гатинга для анализа одиночных В-клеток CXCR5 и фолликулярно-хелперных Т-клеток, выделенных из небных миндалин человека. Эта стратегия последовательного измерения определяет отдельные живые события в окне непрерывного сбора. Здесь показаны дублеты, экспрессия icam-1 на клеточной поверхности по сравнению с контролем FMO и контролем FMO, помеченными соответствующими изотипами популяций.
Здесь показаны измерение МФО из различных стандартных популяций MESF в наложенных гистограммах популяций MESF. Значения представляют собой МФО для каждой из пяти популяций MESF. Здесь представлена линейная регрессия MESF по cMFI для популяций MESF.
Наклон извлекает MESF, связанный с клетками из данных FCM ICAM-1 на поверхности тонзиллярных В-клеток в TFH. Преобразование в абсолютные молекулярные плотности следует этим простым математическим операциям. Репрезентативные изображения показывают анализ проточной цитометрии BSLB, восстановленных с повышенной плотностью рекомбинантных мономерных гистидинов ICAM-1 12.
Здесь показаны регрессионные анализы эталонной концентрации ICAM-1 по измеренной плотности. Наклон используется для расчета целевых концентраций белка для достижения плотности клеток. Блок-схемы показывают критические этапы совместного культивирования Т-клеток с BSLB, воссоздания модельных мембран при последующем измерении переноса частиц с помощью проточной цитометрии.
Стратегия определения отдельных BSLB и ячеек в окне непрерывного сбора показана здесь. Одним из наиболее важных аспектов этого протокола является то, что для поддержания воспроизводимости результатов каждый раз, когда вы изменяете запасы белка или липидов, вам необходимо выполнять новый калибровочный анализ. Чтобы обнаружить новые эффективные молекулы, секретируемые различными подмножествами Т-клеток, BSLB могут быть дополнительно выделены путем флуоресцентно-активированной сортировки клеток, подвергающейся транскриптомному и протеомному анализу.
Наши коллеги из Оксфордского университета использовали эту технологию для изучения и демонстрации новых взаимодействий рецептор-лиганд, а также для изучения влияния генетических абляций на выход иммунного синапса Т-клеток.
