El estudio de la producción de la sinapsis inmune se ha restringido principalmente a métodos microscópicos. Los BSLB han ampliado nuestro repertorio de herramientas que se pueden utilizar para estudiar la producción de sinapsis inmunes de células T, incluida la citometría de flujo, la microscopía, la proteómica y las tecnologías de secuenciación de ARN. Como tal, los BSLB se pueden utilizar en una amplia variedad de preguntas de inmunología y en la identificación de la composición y la regulación bioquímica de la producción de células T.
Esto incluye, por ejemplo, el estudio de receptores de antígenos quiméricos, medicamentos que inhiben vías de señalización específicas o la ablación genética de genes de interés. Uno de los aspectos más críticos de este protocolo es optimizar las calibraciones de proteínas y el panel de citometría de flujo multicolor necesario para el seguimiento de la partícula transsináptica de interés. Esto requiere la iteración sistemática de las concentraciones de proteínas, las concentraciones de anticuerpos y la configuración del instrumento.
Comience diluyendo un microlitro de solución de perlas con 1, 000 microlitros de PBS. Cuente las cuentas usando una cámara hemocitómetro y calcule su concentración por mililitro. Luego, calcule el volumen de cuentas de sílice necesarias para 500, 000 BSLB finales por punto de titulación.
Transfiera el volumen requerido de perlas de sílice a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros. Lave las cuentas de sílice tres veces con un mililitro de PBS estéril y centrifugue las perlas. Prepare tres volúmenes de mezcla maestra de liposomas que contengan un porcentaje final de 12.5 moles de fosfolípidos que contienen níquel.
Use la mezcla maestra de liposomas para resuspendir las cuentas de sílice lavadas. Luego, mézclelo suavemente canalizando hacia arriba y hacia abajo la mitad del volumen total. Usando una técnica estéril, agregue argón o gas nitrógeno al tubo para desplazar el aire y proteger los lípidos de la oxidación durante la mezcla.
Agregue argón a las reservas de lípidos 0.4 milimolares. Almacenar el stock y manipular mediante una técnica estéril. Mueva los BSLB al mezclador vertical y mezcle durante 30 minutos a temperatura ambiente utilizando la mezcla orbital a 10 RPM.
Luego, gire las cuentas centrifugando durante 15 segundos a temperatura ambiente en una minicentrífuga de sobremesa. Bloquee los BSLB formados agregando un mililitro de BSA al 5% que contenga 100 micromolares de sulfato de níquel para saturar los sitios de NTA en los BSLB. Lave tres veces con tampón HBS-HSA para eliminar el exceso de solución de bloqueo.
Tome una nueva placa de 96 pocillos con fondo en U o con fondo en V y prepare diluciones en serie dobles de las proteínas. Resuspender los BSLB preparados en un volumen tal que 100 microlitros de tampón HBS-HSA contengan 500, 000 BSLB. Luego, tome otra placa de 96 pocillos con fondo en U o V y transfiera 100 microlitros de la suspensión BSLB a los pozos de tal manera que cada pozo reciba 500, 000 BSBL.
Gire la segunda placa a temperatura ambiente durante dos minutos a 300x G.Deseche el sobrenadante y transfiera volúmenes de 100 microlitros de la placa de titulación de proteínas a la placa que contiene los BSLB sedimentados. Mezcle suavemente, evitando el exceso de generación de burbujas mientras pipetea. Use papel de aluminio para protegerlo de la luz e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos a 1, 000 RPM.
Luego, lave la placa tres veces agregando tampón HBS-HSA a la placa y gírela hacia abajo a temperatura ambiente durante dos minutos a 300x G.Cuente las células después del lavado. Luego, diluirlos a una concentración final de 2.5 millones por mililitro usando un medio de ensayo de transferencia sináptica. Una vez que los BSLB estén cargados con la mezcla de proteínas, lave los BSLB dos veces con tampón HBS-HSA para eliminar el exceso de proteínas no unidas.
Resuspend 500, 000 BSLB por pozo en 200 microlitros de tampón HBS-HSA. Transfiera 100 microlitros de BSLB por pozo a una nueva placa de 96 pocillos con fondo en U para hacer un duplicado, de modo que la cantidad final de BSLB por pozo sea de 250, 000. Gire los BSLB a 300x G durante dos minutos a temperatura ambiente.
Deseche el sobrenadante y luego vuelva a suspender los BSLB utilizando 100 microlitros de suspensión de células T. Mezclar suavemente para evitar la formación de burbujas. Incubar los cocultivos durante 90 minutos a 37 grados centígrados.
Proteja las células de la luz y enfríe los cocultivos incubándolos primero a temperatura ambiente durante un mínimo de 15 minutos. Centrifugar los cocultivos a temperatura ambiente durante cinco minutos a 500x G.Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los cocultivos en PBS BSA libre de iones de calcio y magnesio al 2% a temperatura ambiente para su bloqueo. Coloque las células en hielo durante 45 minutos y protéjalas de la luz.
Prepare la mezcla maestra de anticuerpos utilizando BSA y PBS 2% filtrados con 0,22 micrómetros como tampón de tinción. Esta mezcla maestra proporcionará un bloqueo adicional. Gira hacia abajo los cocultivos a 500x G durante cinco minutos y cuatro grados centígrados.
Deseche los sobrenadantes y luego use una pipeta multicanal para resuspendir las células en la mezcla maestra de tinción que contiene concentraciones optimizadas de anticuerpos. Incluye células marcadas con isotipo y BSLB, BSLB fluorescentes y no fluorescentes, y células y BSLB teñidas solas. Mezclar suavemente canalizando hacia arriba y hacia abajo la mitad del volumen.
Incubar durante 30 minutos sobre hielo y protegerlos de la luz. Lave las células y los BSLB dos veces con PBS BSA 2% frío y helado. Hágalos girar a 500x G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Después de la centrifugación, verifique el cocultivo sedimentado en el fondo de los pozos. Luego, vuelva a suspender los cocultivos lavados en 100 microlitros de PBS y adquiera inmediatamente. Active la escala de registro para la luz dispersada lateralmente y el parámetro de tiempo de vuelo para las luces dispersas laterales y delanteras.
Adquiera los estándares MESF, asegurando que tanto las poblaciones tenues como las más brillantes caigan en el rango lineal del instrumento. Luego, adquiera muestras de compensación, calcule la compensación y aplique la matriz de compensación al experimento. Adquiera y guarde un mínimo de 20,000 estándares MESF totales para cada canal de cuantificación.
Evite el uso de líquido de vaina FACS o similar a las perlas MESF resuspend, ya que contienen sales y alcoholes que destruirán los fluorocromos, lo que provocará picos de fluorescencia más amplios y un alto error. Para la adquisición utilizando muestreadores de alto rendimiento, establezca la adquisición de instrumentos en Estándar, establezca la adquisición de muestras en 80 microlitros. Caudal de muestreo entre dos y tres microlitros por segundo, volumen de mezcla de muestra a 50 microlitros, mezcla de muestra de 150 microlitros por segundo y mezcla por pozo entre tres y cinco.
Adquirir un mínimo de 10.000 BSLB individuales por muestra. Finalmente, exporte los archivos FCS. Aquí se muestra un ejemplo de mediciones cuantitativas de citometría de flujo de ICAM-1 en la superficie de las células B amigdalares y las células T auxiliares.
Las imágenes representativas describen la estrategia de gating para analizar células B CXCR5 individuales y células T foliculares auxiliares aisladas de amígdalas palatinas humanas. Esta estrategia de cierre secuencial identifica eventos en vivo individuales dentro de la ventana de adquisición continua. Los dobletes, la expresión de la superficie celular de ICAM-1 en comparación con los controles FMO y los controles FMO etiquetados con isotipos relevantes de las poblaciones, se muestran aquí.
Aquí se muestran las indicaciones y la medición de las IMF de diferentes poblaciones estándar de MESF en los histogramas superpuestos de las poblaciones de MESF. Los valores representan las IMF para cada una de las cinco poblaciones de MESF. Aquí se presenta la regresión lineal de MESF sobre cMFI para las poblaciones de MESF.
La pendiente extrae MESF unido a células de los datos FCM de ICAM-1 en la superficie de las células B amigdalares en TFH. La conversión a densidades moleculares absolutas sigue estas operaciones matemáticas simples. Las imágenes representativas muestran el análisis de citometría de flujo de BSLB reconstituidos con mayores densidades de ICAM-1 12 histidinas monoméricas recombinantes.
Aquí se muestran los análisis de regresión de la concentración de referencia ICAM-1 sobre la densidad medida. La pendiente se utiliza para calcular las concentraciones objetivo de proteína para lograr la densidad de las células. Los diagramas de flujo muestran los pasos críticos para el co-cultivo de células T con BSLBs, reconstituyendo membranas modelo en la posterior medición de la transferencia de partículas con citometría de flujo.
La estrategia de cierre para identificar BSLB y celdas individuales dentro de la ventana de adquisición continua se muestra aquí. Uno de los aspectos más importantes de este protocolo es que, para mantener la reproducibilidad de los resultados, cada vez que cambie las reservas de proteínas o lípidos, debe realizar un nuevo análisis de calibración. Para descubrir nuevas moléculas efectivas secretadas por diferentes subconjuntos de células T, los BSLB se pueden aislar aún más mediante la clasificación celular activada por fluorescencia como se someten a análisis transcriptómicos y proteómicos.
Nuestros colegas de la Universidad de Oxford han utilizado esta tecnología para estudiar y demostrar nuevas interacciones receptor-ligando, y también para estudiar los efectos de las ablaciones genéticas en la producción de la sinapsis inmune de las células T.
