면역 시 냅 스의 출력의 연구 는 현미경 방법으로 주로 제한 되었습니다. BSLB는 유동 세포측정, 현미경 검사법, 프로테오믹스 및 RNA 염기서열 분석 기술을 포함하여 T 세포 면역 시냅스의 출력을 연구하는 데 사용할 수 있는 공구의 레퍼토리를 확장했습니다. 이와 같이, BSLB는 다양한 면역학 질문에서 사용할 수 있으며 T 세포 출력의 조성 및 생화학적 조절을 식별할 수 있다.
이것은, 예를 들면, 키메라 항원 수용체의 연구 결과, 특정 신호 통로를 억제하는 약, 또는 관심있는 유전자의 유전 절제를 포함합니다. 이 프로토콜의 가장 중요한 측면 중 하나는 관심있는 시냅스 입자를 추적하는 데 필요한 단백질 교정 및 다색 흐름 세포 측정 패널을 최적화하는 것입니다. 이를 위해서는 단백질 농도, 항체 농도 및 기기 설정의 체계적인 반복이 필요합니다.
PBS의 1, 000 마이크로리터와 비드 용액의 마이크로리터 1개를 희석하는 것으로 시작합니다. 혈전계 챔버를 사용하여 구슬을 계산하고 밀리리터당 농도를 계산합니다. 그런 다음 적정 점당 500, 000 최종 BSLB에 필요한 실리카 구슬의 양을 계산합니다.
실리카 구슬의 필요한 부피를 멸균 1.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브로 이송합니다. 실리카 구슬을 멸균 PBS 1밀리리터로 세 번 씻고 구슬을 원심분리합니다. 니켈 함유 인지질의 최종 12.5 두더지 퍼센트를 포함하는 3권의 리포솜 마스터 믹스를 준비합니다.
리포솜 마스터 믹스를 사용하여 세척된 실리카 구슬을 재보습합니다. 그런 다음 총 볼륨의 절반을 위아래로 파이프로 부드럽게 섞습니다. 멸균 기술을 사용하여, 공기를 대체하고 혼합하는 동안 산화로부터 지질을 보호하기 위해 튜브에 아르곤 또는 질소 가스를 추가합니다.
0.4 밀리머 지질 주식에 아르곤을 추가합니다. 스톡을 보관하고 멸균 기술을 사용하여 조작하십시오. BSLB를 수직 믹서로 이동하고 10 RPM에서 궤도 혼합을 사용하여 실온에서 30 분 동안 혼합하십시오.
그런 다음 벤치 탑 미니 원심 분리기에서 실온에서 15 초 동안 원심 분리하여 구슬을 회전시합니다. BSLB의 NTA 부위를 포화시키는 니켈 황산염 100 마이크로몰라를 포함하는 5%BSA의 밀리리터 1밀리리터를 첨가하여 형성된 BSLB를 차단합니다.
새로운 U-바닥 또는 V-바닥 96-well 플레이트를 가지고 단백질의 두 배 연속 희석을 준비합니다. HBS-HSA 버퍼의 100 마이크로리터가 500, 000 BSLB를 함유할 수 있도록 준비된 BSLB를 부피로 재보선한다. 그런 다음, 다른 U-바닥 또는 V-바닥 96-웰 플레이트를 가지고 각각 잘 500, 000 BSBLs를 수신하는 방식으로 BSLB 서스펜션의 100 마이크로 리터를 우물로 전송합니다.
300x G.에서 2분 동안 실온에서 두 번째 플레이트를 스핀다운하고 단백질 적정판에서 퇴적BSLB를 함유한 플레이트로 100마이크로리터 부피를 전달합니다. 알루미늄 호일을 사용하여 1, 000 RPM에서 30 분 동안 실온에서 가볍고 배양하십시오.
이어서, 플레이트에 HBS-HSA 버퍼를 추가하여 플레이트를 세 번 세척하고 세탁 후 세포를 300x G.Count에서 2분 동안 실온에서 아래로 회전시한다. 그런 다음 시냅스 전달 분석 매체를 사용하여 밀리리터 당 250만 의 최종 농도로 희석합니다. BSLB가 단백질 믹스로 로드되면 HBS-HSA 버퍼로 BSLB를 두 번 세척하여 과도한 결합되지 않은 단백질을 제거하십시오.
HBS-HSA 버퍼 200 마이크로리터에서 500, 000 BSLB를 재중단합니다. 100 마이크로리터의 BSLB를 새로운 U-bottom 96-well 플레이트로 전송하여 복제할 수 있으며, 따라서 우물당 BSLB의 최종 양은 250, 000입니다. 실온에서 2분 동안 300x G에서 BSLB를 회전시보시면 됩니다.
상체를 폐기한 다음 T 셀 서스펜션의 100 마이크로리터를 사용하여 BSLB를 다시 중단합니다. 거품의 형성을 방지하기 위해 부드럽게 혼합. 섭씨 37도에서 90분 동안 공동 문화를 배양합니다.
빛으로부터 세포를 보호하고 최소 15 분 동안 실온에서 먼저 배양하여 공동 배양을 식힙니다. 원심분리는 500x G.에서 5분 동안 실온에서 공동 배양을 제거하고 칼슘과 마그네슘 이온이 없는 2% BSA PBS의 공동 배양을 차단용실온에서 재보선다. 세포를 얼음 위에 45분 간 놓고 빛으로부터 보호합니다.
얼음-차가운 0.22 마이크로미터-여과 2%BSA 및 PBS를 염색 버퍼로 사용하여 항체 마스터 믹스를 준비한다. 이 마스터 믹스는 추가 차단을 제공합니다. 500x G에서 5분, 섭씨 4도로 공동 배양을 회전시다.
수퍼나티를 폐기한 다음 다중 채널 파이펫을 사용하여 최적화된 항체 농도를 포함하는 염색 마스터 믹스에서 세포를 재일시 중단합니다. 동형 표지 된 세포와 BSLBs, 형광 및 비 형광 BSLBs, 세포 및 BSLB단독으로 염색 포함. 볼륨의 위쪽과 아래쪽을 피펫하여 부드럽게 섞습니다.
얼음에 30 분 동안 배양하고 빛으로부터 보호하십시오. 얼음 차가운 2 % BSA PBS를 사용하여 셀과 BSLB를 두 번 세척하십시오. 섭씨 4도에서 5분간 500x G로 회전합니다.
원심분리 후 우물 바닥에 퇴적한 공동 배양을 확인하십시오. 그런 다음, PBS의 100 마이크로 리터에서 세척 된 공동 배양을 다시 중단하고 즉시 취득합니다. 측면 산란 된 라이트와 측면 및 전방 분산 조명에 대한 비행 시간 매개 변수에 대한 로그 스케일을 활성화합니다.
MESF 표준을 획득하여 딤세트와 가장 밝은 개체수가 계측기의 선형 범위에 속하도록 보장합니다. 그런 다음 보상 샘플을 획득하고 보상을 계산하고 보상 매트릭스를 실험에 적용합니다. 각 정량화 채널에 대해 최소 20, 000개의 총 MESF 표준을 획득하고 저장합니다.
이러한 더 넓은 형광 피크와 높은 오류로 이어지는, 불소 크롬을 파괴 하는 소금과 알코올을 포함 하 여 MESF 구슬을 다시 중단 하기 위해 FACS 칼집 또는 이와 유사한 사용 하지 마십시오. 고처리량 샘플러를 사용하여 획득하기 위해 기기 를 표준으로 설정하고 샘플 수집을 80 마이크로리터로 설정합니다. 초당 2~3마이크로리터 사이의 샘플 유량, 50마이크로리터의 샘플 혼합 볼륨, 초당 150마이크로리터의 샘플 혼합, 3~5회 사이웰당 혼합.
샘플당 최소 10, 000개의 단일 BSLB를 획득합니다. 마지막으로 FCS 파일을 내보냅니다. 편도선 B 세포 및 도우미 T 세포의 표면에 ICAM-1의 정량적 유량 세포 측정측정의 예가 여기에 나와 있다.
대표적인 이미지는 인간 팔라틴 편도선으로부터 분리된 단일 CXCR5 B 세포 및 여포 도우미 T 세포를 분석하기 위한 게이팅 전략을 설명합니다. 이 순차 적 게이팅 전략은 연속 수집 창 내에서 단일 라이브 이벤트를 식별합니다. 이중, FMO 컨트롤 및 인구의 관련 등류형으로 표지된 FMO 컨트롤에 비해 ICAM-1의 세포 표면 발현이 여기에 나와 있다.
MESF 인구의 오버레이 히스토그램에 있는 다른 표준 MESF 인구에서 MF의 게이팅 및 측정은 여기에서 표시됩니다. 값은 5개의 MESF 모집단 각각에 대한 M파이를 나타냅니다. MESF 인구에 대한 cMFI를 통해 MESF의 선형 회귀가 여기에 제시됩니다.
경사는 TFH에서 편도선 B 세포의 표면에 ICAM-1의 FCM 데이터에서 셀에 결합 된 MESF를 추출합니다. 절대 분자 밀도로의 변환은 이러한 간단한 수학적 작업을 따릅니다. 대표적인 이미지는 재조합 단황 ICAM-1 12 히스티딘의 밀도증가로 재구성된 BSLB의 유동 세포분석분석을 보여준다.
측정된 밀도에 대한 ICAM-1 기준 농도의 회귀 분석은 여기에 나와 있다. 경사는 세포의 밀도를 달성하기 위해 단백질의 목표 농도를 계산하는 데 사용됩니다. 흐름 다이어그램은 BSLB와 T 세포를 공동 배양하기 위한 중요한 단계를 보여 주며, 흐름 세포측정을 사용하여 입자 전달의 후속 측정에서 모델 멤브레인을 재구성합니다.
연속 획득 창 내에서 단일 BSLB 및 셀을 식별하는 게이팅 전략이 여기에 표시됩니다. 이 프로토콜의 가장 중요한 측면 중 하나는 결과의 재현성을 유지하기 위해 단백질 이나 지질 주식을 변경할 때마다 새로운 교정 분석을 수행해야한다는 것입니다. 다른 T 세포 서브셋에 의해 분비되는 새로운 효과적인 분자를 발견하기 위해, BSLB는 전사 및 프로테오믹 분석을 실시하는 바와 같이 형광 활성화 세포 분류에 의해 더 격리될 수 있다.
옥스포드 대학 내의 우리의 동료는 연구하고 새로운 수용체 리간드 상호 작용을 입증하기 위해이 기술을 사용하고, 또한 T 세포 면역 시냅스의 출력에 유전 적 절제의 효과를 연구하기 위해.
