高效且具有成本效益的电穿孔方法研究颗粒细胞前体中的原代纤毛依赖性信号通路

该协议展示了一种直接的体外遗传修饰方法，用于原代颗粒细胞前体培养物中原代纤毛依赖性信号通路的分子研究。由于当前转染方法的成本、低生存率和低效率，我们引入了一种简单、经济高效且高效的电穿孔技术，用于研究原代 GCP 培养物中纤毛依赖性信号通路。首先，将0.5毫升培养基加入含有涂层盖玻片的24孔培养板的每个孔中，并在二氧化碳培养箱中将其保持在37摄氏度的温度下。

将所需数量的细胞移入无菌的1.5毫升微量离心管中，并在室温下以200x G旋转5分钟。弃去上清液并将细胞沉淀重悬于200微升Opti-MEM中。重复此过程两次，以确保管中不存在残留的培养基。

设置列出的电穿孔参数。轻轻地移取电穿孔反应以充分混合，并使用长P200移液器尖端将精确体积的100微升混合物转移到两毫米间隙比色皿中。一旦比色皿进入比色皿室，按下电吸管的omega按钮，并通过坚持100微升的精确体积来注意阻抗值。

阻抗值的范围应约为 30 和 35。按下开始按钮以启动脉冲。记录读数框上显示的测量电流值（以焦耳为单位）。

从腔室中取出比色皿。立即将100微升预热的培养基加入比色皿中，并通过上下移液两到三次来重悬。立即将细胞悬浮液转移到先前制备的24孔板中。

在二氧化碳培养箱中以37摄氏度孵育细胞。第二天在荧光显微镜下观察细胞。在本研究中，DMSO和SAG处理组的电穿孔效率似乎相当。

原代纤毛标志物 Arl13b 的免疫染色表明，在载体组和 SAG 处理组的培养物中，GCP 在 div-2 处的纤毛化率。纤毛率说明了在电穿孔后div-2时表达在细胞表面上具有初级纤毛的Pax6表达GCP的百分比。该图显示，在SAG治疗后24小时，Pax6表达GCP细胞原发性纤毛轴突上的平滑EGFP定位显着增加，表明原发性纤毛依赖性刺猬信号通路的深度激活。

为了实现更高的电穿孔效率，应确保所用质粒的高纯度，并且质粒电穿孔混合物中不存在残留培养基。该协议应直接适用于难以转染的原代培养物和细胞类型（包括神经元和人类诱导的多能干细胞）的体外遗传修饰实验。