Dieses Protokoll demonstriert eine einfache in vitro genetische Modifikationsmethode für die molekulare Untersuchung des primären Cilium-abhängigen Signalwegs in den primären Granulazell-Vorläuferkulturen. Aufgrund der Kosten, der geringen Lebensfähigkeit und der geringen Effizienz der aktuellen Transfektionsmethode führen wir eine einfache, kostengünstige und effiziente Elektroporationstechnik zur Untersuchung des Cilium-abhängigen Signalwegs in primären GCP-Kulturen ein. Geben Sie zunächst 0,5 Milliliter Kulturmedium in jede Vertiefung der 24-Well-Kulturplatte mit beschichteten Deckblättern und halten Sie sie bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator warm.
Die erforderliche Anzahl von Zellen in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren und bei Raumtemperatur fünf Minuten lang bei 200x G drehen. Entsorgen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet in 200 Mikrolitern Opti-MEM. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal, um sicherzustellen, dass kein Restkulturmedium in der Röhre vorhanden ist.
Stellen Sie die Parameter der Elektroporation wie aufgeführt ein. Die Elektroporationsreaktion vorsichtig pipettieren, um gut zu mischen, und verwenden Sie eine lange P200-Pipettenspitze, um ein genaues Volumen von 100 Mikrolitern der Mischung in die Zwei-Millimeter-Spaltküvette zu übertragen. Sobald sich die Küvette in der Küvettenkammer befindet, drücken Sie die Omega-Taste des Elektroporators und notieren Sie den Impedanzwert, indem Sie sich an ein genaues Volumen von 100 Mikrolitern halten.
Der Impedanzbereich sollte ungefähr 30 und 35 betragen. Drücken Sie die Starttaste, um den Impuls zu starten. Zeichnen Sie die gemessenen Aktuellewerte in Joule auf, die auf dem Leserahmen angezeigt werden.
Nehmen Sie die Küvette aus der Kammer. Sofort 100 Mikroliter vorgewärmtes Kulturmedium in die Küvette geben und durch zwei- bis dreimaliges Pipettieren resuspendieren. Übertragen Sie die Zellsuspension sofort auf die zuvor vorbereitete 24-Well-Platte.
Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator. Beobachten Sie die Zellen am nächsten Tag unter dem Fluoreszenzmikroskop. In der vorliegenden Studie schien die Elektroporationseffizienz von DMSO- und SAG-behandelten Gruppen vergleichbar zu sein.
Die Immunfärbung des primären Ciliummarkers Arl13b zeigt, dass die Flimmerrate von GCP bei div-2 der Kultur sowohl in der Vehikel- als auch in der SAG-behandelten Gruppe erfolgt. Die Kiliationsrate veranschaulicht den Prozentsatz der Pax6-exprimierenden GCPs, die ein primäres Cilium auf der Zelloberfläche bei div-2 nach der Elektroporation tragen. Die Abbildung zeigt einen signifikanten Anstieg der geglätteten EGFP-Lokalisation auf dem primären Ciliumaxtonem von Pax6-Expressions-GCP-Zellen 24 Stunden nach der SAG-Behandlung, was auf eine tiefgreifende Aktivierung des primären Cilium-abhängigen Hedgehog-Signalwegs hinweist.
Um eine höhere Elektroporationseffizienz zu erreichen, sollte eine hohe Reinheit des verwendeten Plasmids sichergestellt werden, und es sind keine Rückstandskulturmedien in der Plasmidelektroporationsmischung vorhanden. Dieses Protokoll sollte für In-vitro-Experimente zur genetischen Veränderung an Primärkulturen und Zelltypen, die schwer zu transfizieren sind, einschließlich Neuronen und humaninduzierter pluripotenter Stammzellen, direkt anwendbar und vorteilhaft sein.
