과립 세포 전구체에서 1 차적인 실륨 의존적 신호 경로를 연구하는 효율적이고 비용 효율적인 전기 포기법

이 프로토콜은 1 차과립 세포 전구체 배양에서 1 차적인 cilium 의존적인 신호 통로의 분자 연구를 위한 간단한 체외 유전 수정 방법을 보여줍니다. 현재 의 경질 전환 방법의 비용, 낮은 생존력 및 효율성 저하로 인해, 우리는 1 차 적인 GCP 배양에서 cilium 의존적인 신호 경로를 조사하기 위한 간단하고 비용 효율적이며 효율적인 전기 기법을 소개합니다. 우선, 코팅된 커버 슬립이 들어있는 24웰 배양판의 각 웰에 0.5 밀리리터의 배양 배지를 추가하고 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 따뜻하게 유지하십시오.

필요한 수의 세포를 멸균 1.5밀리리터 미세원심분리기 튜브로 파이프하고 실온에서 5분 동안 200x G에서 회전합니다. 상체를 버리고 Opti-MEM의 200 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오. 이 절차를 두 번 반복하여 잔류 배양 배지가 튜브에 존재하지 않도록 합니다.

전자기화 매개 변수를 나열된 대로 설정합니다. 파이펫 은 전자 기화 반응을 부드럽게 잘 혼합하고 긴 P200 파이펫 팁을 사용하여 혼합물의 100 마이크로 리터의 정확한 부피를 2 밀리미터 갭 큐벳으로 전송합니다. 큐벳이 큐벳 챔버 내부에 들어가면 전기포레이터의 오메가 버튼을 누르고 100 마이크로리터의 정확한 볼륨을 고수하여 임피던스 값을 기록하십시오.

임피던스 값의 범위는 약 30 및 35여야 합니다. 시작 버튼을 눌러 펄스를 시작합니다. 판독 프레임에 표시된 줄에 측정된 전류 값을 기록합니다.

챔버에서 큐벳을 제거합니다. 즉시 100 마이크로리터의 미리 따뜻해지는 배양 배지를 큐벳에 넣고 2~3회 위아래로 피펫팅하여 재장매합니다. 셀 서스펜션을 이전에 준비한 24웰 플레이트로 즉시 전송합니다.

이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 다음 날 형광 현미경의 밑에 세포를 관찰하십시오. 본 연구에서는, DMSO 및 SAG 처리군의 전기기화 효율이 비교되는 것으로 나타났다.

1차 실슘 마커 Arl13b의 면역염색은 차량과 SAG 처리된 그룹 모두에서 배양의 div-2에서 GCP의 모양 속도를 입증한다. 섬광 속도는 div-2 후 전기포화에서 세포 표면에 1차 실슘을 베어링하는 GCP를 발현하는 Pax6의 백분율을 보여줍니다. 이 수치는 Pax6 발현 GCP 세포의 1차 실륨 액소네메에 대한 부드러운 EGFP 국소화가 SAG 후 24시간 동안 유의하게 증가하여 1차 고슴도치 신호 경로의 심오한 활성화를 나타낸다.

더 높은 전기포기 효율을 달성하기 위해서는 사용되는 플라스미드의 고순도를 보장해야 하며, 잔류물 배양 매체는 플라스미드 전기포기 혼합물에 존재하지 않는다. 이 프로토콜은 뉴런과 인간이 유발한 만능 줄기 세포를 포함하여 트랜스펙트하기 어려운 1 차 배양 및 세포 유형에 대한 체외 유전자 변형 실험에 직접적으로 적용되고 유익해야 합니다.