Bu protokol, primer granül hücre öncüsü kültürlerde primer ekium bağımlı sinyal yolunun moleküler çalışması için basit bir in vitro genetik modifikasyon yöntemini göstermektedir. Mevcut transeksiyon yönteminin maliyeti, düşük canlılığı ve düşük verimliliği nedeniyle, birincil GCP kültürlerinde ekyuma bağımlı sinyal yolunu araştırmak için basit, uygun maliyetli ve verimli bir elektroporasyon tekniği sunuyoruz. Başlamak için, kaplamalı kapak kaymaları içeren 24 kuyulu kültür plakasının her kuyusuna 0,5 mililitre kültür ortamı ekleyin ve karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede sıcak tutun.
Gerekli sayıda hücreyi steril 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200x G'de döndürün. Süpernatantı atın ve hücre peletini 200 mikrolitre Opti-MEM'de yeniden dirildi. Tüpte artık kültür ortamı olmadığından emin olmak için bu prosedürü iki kez tekrarlayın.
Elektroporasyon parametrelerini listelendiği gibi ayarlayın. Elektroporasyon reaksiyonunu iyice karıştırmak için hafifçe pipetleyin ve karışımın 100 mikrolitrelik tam hacmini iki milimetrelik boşluk cuvette'e aktarmak için uzun bir P200 pipet ucu kullanın. Cuvette haznenin içine girdikten sonra, elektroporatörnün omega düğmesine basın ve 100 mikrolitrelik hassas bir hacme bağlı olarak empedans değerini not edin.
Empedans değeri aralığı yaklaşık 30 ve 35 olmalıdır. Nabzı başlatmak için başlat düğmesine basın. Ölçülen geçerli değerleri okuma çerçevesinde gösterilen Joules olarak kaydedin.
Cuvette'i odadan çıkarın. Hemen cuvette içine önceden ısıtılmış kültür ortamının 100 mikrolitresini ekleyin ve iki ila üç kez yukarı ve aşağı pipetlenerek yeniden diriltin. Hücre süspansiyonu hemen önceden hazırlanmış 24 kuyu plakasına aktarın.
Hücreleri karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede kuluçkaya yatır. Ertesi gün floresan mikroskobu altındaki hücreleri gözlemleyin. Bu çalışmada, DMSO ve SAG ile tedavi edilen grupların elektroporasyon verimliliği karşılaştırılabilir olarak ortaya çıkmıştır.
Birincil siliyum işaretleyici Arl13b'nin immünostainasyonu, hem araç hem de SAG ile tedavi edilen gruplarda kültürün div-2'sinde GCP'nin siliasyon oranının olduğunu göstermektedir. Siliasyon oranı, div-2 post-electroporation'da hücre yüzeyinde birincil cilium taşıyan Pax6 eksprese edici GCP'lerin yüzdesini gösterir. Bu rakam, SAG sonrası 24 saat süren GCP hücrelerinin primer siyez akoneminde yumuşatılmış EGFP lokalizasyonunda önemli bir artış olduğunu ve birincil seyuma bağımlı kirpi sinyal yolunun derin bir aktivasyonunu göstermektedir.
Daha yüksek bir elektroporasyon verimliliği elde etmek için, kullanılan plazmidin yüksek saflığını sağlamalıdır ve plazmid elektroporasyon karışımında kalıntı kültür ortamı yoktur. Bu protokol, nöronlar ve insan kaynaklı pluripotent kök hücreler de dahil olmak üzere transfect edilmesi zor olan birincil kültürler ve hücre tipleri üzerinde in vitro genetik modifikasyon deneyleri için doğrudan uygulanabilir ve faydalı olmalıdır.
