Questo protocollo dimostra un semplice metodo di modificazione genetica in vitro per lo studio molecolare della via di segnalazione primaria cilium-dipendente nelle colture precursori di cellule granuliche primarie. A causa del costo, della bassa redditività e della scarsa efficienza dell'attuale metodo di trasfezione, introduciamo una tecnica di elettroporazione semplice, economica ed efficiente per studiare la via di segnalazione dipendente dal cilio nelle colture primarie GCP. Per iniziare, aggiungere 0,5 millilitri di terreno di coltura in ciascun pozzetto della piastra di coltura a 24 pozzetti contenente scivoli di copertura rivestiti e tenerlo caldo a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica.
Pipettare il numero richiesto di celle in un tubo microcentrifuga sterile da 1,5 millilitri e ruotare a 200x G per cinque minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospesciare il pellet cellulare in 200 microlitri di Opti-MEM. Ripetere questa procedura due volte per assicurarsi che nel tubo non sia presente alcun terreno di coltura residuo.
Impostare i parametri di elettroporazione come elencato. Pipettare delicatamente la reazione di elettroporazione per mescolare bene e utilizzare una lunga punta della pipetta P200 per trasferire un volume esatto di 100 microlitri della miscela nella cuvetta a due millimetri di spazio. Una volta che la cuvetta si trova all'interno della camera della cuvetta, premere il pulsante omega dell'elettroporatore e annotare il valore di impedenza aderendo a un volume preciso di 100 microlitri.
L'intervallo del valore di impedenza dovrebbe essere approssimativamente 30 e 35. Premere il pulsante di avvio per avviare l'impulso. Registrate i valori correnti misurati in Joule mostrati sul fotogramma di lettura.
Rimuovere la cuvetta dalla camera. Aggiungere immediatamente 100 microlitri di terreno di coltura preriscaldato nella cuvetta e risospesa mediante pipettaggio su e giù due o tre volte. Trasferire immediatamente la sospensione cellulare sulla piastra a 24 pozzetti precedentemente preparata.
Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica. Osservare le cellule al microscopio a fluorescenza il giorno seguente. Nel presente studio, l'efficienza di elettroporazione dei gruppi trattati con DMSO e SAG è apparsa comparabile.
L'immunocolorazione del marcatore cilio primario Arl13b dimostra che il tasso di ciliazione di GCP a div-2 di coltura sia nel veicolo che nei gruppi trattati con SAG. Il tasso di ciliazione illustra la percentuale di GCP che esprimono Pax6 che portano un cilio primario sulla superficie cellulare a div-2 post-elettroporazione. La figura mostra un aumento significativo della localizzazione EGFP levigata sull'axoneme cilium primario delle cellule GCP di espressione Pax6 a 24 ore dopo il trattamento SAG, indicando una profonda attivazione della via di segnalazione primaria del riccio cilium-dipendente.
Al fine di ottenere una maggiore efficienza di elettroporazione, si dovrebbe garantire un'elevata purezza del plasmide utilizzato e nessun mezzo di coltura residuo è presente nella miscela di elettroporazione plasmidica. Questo protocollo dovrebbe essere direttamente applicabile e vantaggioso per esperimenti di modificazione genetica in vitro su colture primarie e tipi di cellule difficili da trasfettare, compresi i neuroni e le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo.
