本プロトコルは、一次顆粒細胞前駆体培養における一次シリウム依存シグナル伝達経路の分子的研究のための簡単なインビトロ遺伝子改変法を示す。コスト、低生存率、そして現在のトランスフェクション法の効率が悪いため、GCP培養のシリウム依存性シグナル伝達経路を調査するためのシンプルで費用対効果の高い効率的なエレクトロポレーション技術を導入しています。まず、コーティングされたカバースリップを含む24ウェル培養プレートの各ウェルに0.5ミリリットルの培養培地を加え、二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で暖かく保ちます。
必要な数の細胞を無菌1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブにピペットし、室温で5分間200x Gでスピンする。上清を捨て、細胞ペレットを200マイクロリットルのOpti-MEMで再懸濁します。チューブ内に残留培養培地が存在しないように、この手順を2回繰り返す。
エレクトロポレーションのパラメータをリストに記載されているように設定します。エレクトロポレーション反応を穏やかに混合し、長いP200ピペットチップを使用して、混合物の正確な体積を2ミリメートルギャップキュベットに移します。キュベットがキュベットチャンバー内に入ったら、エレクトロポレーターのオメガボタンを押し、100マイクロリットルの正確な体積に従ってインピーダンス値を確認します。
インピーダンス値の範囲は、約 30 と 35 である必要があります。開始ボタンを押してパルスを開始します。読み取りフレームに表示されるジュールに、計測された電流値を記録します。
チャンバーからキュベットを取り外します。すぐに100マイクロリットルの予温培養培地をキュベットに加え、2~3回上下にピペットで再懸濁する。すぐに、細胞懸濁液を、前に準備した24ウェルプレートに移す。
二酸化炭素インキュベーターで37°Cで細胞をインキュベートします。翌日、蛍光顕微鏡下で細胞を観察します。本研究では、DMSO及びSAG処理群のエレクトロポレーション効率が同等に見えた。
一次シリウムマーカーArl13bの免疫染色は、車両およびSAG処理群の両方における培養物のdiv-2におけるGCPの毛型化率を示す。この毛様化速度は、div-2ポストエレクトロポレーションで細胞表面に第一のシリウムを有するGCPを発現するPax6の割合を示す。この図は、SAG後24時間の処理におけるPax6発現GCP細胞の一次シリウム軸根に対する平滑化EGFP局在化の有意な増加を示し、一次シリウム依存性ヘッジホッグシグナル伝達経路の深い活性化を示す。
より高いエレクトロポレーション効率を達成するためには、使用されるプラスミドの純度が高く、プラスミドエレクトロポレーション混合物に残留培養培地が存在しない必要があります。このプロトコルは、ニューロンやヒトが誘発する多能性幹細胞を含む、トランスフェクトが困難な一次培養および細胞タイプに関するインビトロ遺伝子改変実験に直接適用され、有益であるべきである。
