从细菌中纯化重组蛋白是一种行之有效的方法。但是，使用这些技术时可能会出现一些问题。拥有从组织中提取蛋白质的方法肯定是有吸引力的。
这种方法的主要优点是可以以生理形式提取蛋白质，包括可能影响其折叠和催化活性的所有相互作用。这种方法可以适应其他感兴趣的蛋白质，并针对其他组织进行修饰。从组织中纯化的蛋白质可以支持高质量抗体和药理学抑制剂的开发。
首先，通过将250毫升PBS与50毫摩尔氟化钠，1毫摩尔苯基甲基磺酰氟，每毫升抑肽素2微克和1毫摩尔活化正钒酸盐混合来制备蛋白质裂解缓冲液。使用0.22微米注射器过滤单元过滤溶液。每克组织用两毫升裂解缓冲液制备试管，并将其放在冰上。
为了制备组织样品，在预先清洁的玻璃板上解剖约100毫克的组织，每个玻璃板放置在聚苯乙烯泡沫盒中的冰上。将组织片段转移到准备好的试管中以进行随后的裂解。为了制备饱和硫酸铵溶液，将500毫升双蒸馏水加热至70摄氏度。
搅拌时，逐渐加入硫酸铵粉末，直至不再溶解硫酸铵。将这种饱和溶液冷却至室温，并将其储存在四摄氏度过夜。为了使猪肾组织均质化，优选通过超声探头超声处理悬浮液，同时将样品保持在冰上。
对于小鼠肝脏组织，使用电动均质机并定期在PBS中洗涤，以防止堵塞，同时将样品保持在冰上。从样品中取出20微升，并在显微镜下检查匀浆组织的细胞是否被适当破坏。否则，重复均质化。
将管子以10， 000倍G在4摄氏度下离心30分钟。将上清液收集在新鲜的管中并将其放在冰上。随后使用0.45微米和0.22微米注射器过滤单元过滤上清液。
将上清液等分到10毫升批次中，并在零下20摄氏度冷冻以进行短期储存，或在零下80摄氏度下冷冻以延长储存时间。制备50微升样品用于SDS-PAGE或蛋白质印迹分析，方法是将10微升5倍SDS样品缓冲液加入40微升上清液中，然后在95摄氏度下沸腾10分钟。根据制造商的说明准备不连续的12.5%聚丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶。
为了进行SDS-PAGE分析，随后用蛋白质标记分子量标准品加载凝胶的孔，5纳克人FAHD1重组蛋白作为阳性对照，20微升待分析的样品，以及剩余的孔和20微升制备的SDS-PAGE样品缓冲液。使用SDS电泳缓冲液在125伏电压下电泳SDS-PAGE凝胶。SDS-PAGE完成后，进行蛋白质印迹分析，使用针对FAHD1的可用抗体探测膜。
在制备上清液等分试样如前所述之后，要么在解冻后处理，要么在蛋白质提取后直接处理而不冷冻样品。使用0.22微米过滤装置过滤样品，以排除解冻后可能的沉淀物。在冰上制备六个1.5毫升管，然后将250微升样品转移到每个管中。
在制备的试管中制备一系列稀释的硫酸铵，并用蛋白质裂解缓冲液将最终体积组成至1， 000微升。将样品在四摄氏度下在管旋转器上孵育过夜。使用台式离心机，在4摄氏度下以10， 000倍G离心30分钟，并小心地将所有上清液转移到单独的管中。
将得到的颗粒风干，并将其中的每一个重悬于1， 000微升的双蒸馏水中。对于上一步中每对重悬的沉淀和上清液，将40微升与10微升的五倍SDS样品缓冲液混合，并在95摄氏度下打开盖子沸腾，直到大部分液体蒸发。然后将沉淀重悬于50%二甲基亚砜的混合物中，在双蒸馏水中。
通过成对加载从重悬沉淀和上清液中提取的样品，然后进行蛋白质印迹分析来执行SDS-PAGE。但是，将凝胶在80伏特下电泳三小时。用阴离子或阳离子交换柱设置FPLC系统。
用五塔体积的20%乙醇在双蒸馏水中洗涤塔，然后用五塔体积的双蒸馏水洗涤塔。通过进样或使用样品泵将样品涂在色谱柱上，并收集流通量。用一列体积的低盐缓冲液洗涤色谱柱。
在三柱体积内设置从100%低盐缓冲液到100%高盐缓冲液的线性梯度洗脱。连续收集一毫升馏分。梯度完成后，继续用高盐缓冲液运行，直到在一柱体积范围内的色谱图中不再检测到蛋白质相关峰。
应用一毫升25%SDS溶解在0.5摩尔氢氧化钠和双蒸馏水中以清洁塔。用三塔体积的双蒸馏水和三塔体积的20%乙醇在双蒸馏水中连续洗涤塔。收集所有峰分数和流通量的SDS-PAGE样品。
将收集的馏分在液氮中冷冻，并将其储存在零下80摄氏度。通过蛋白质印迹探测它们后，解冻并池化含有目标蛋白质的馏分并丢弃其他部分。为了执行纯化步骤，使用超离心过滤单元将蛋白质溶液的体积减少到两毫升。
用0.45微米和0.22微米注射器过滤单元按顺序过滤溶液，以去除任何微沉淀。用一列体积的含有一毫摩尔二硫舒醇的电泳缓冲液平衡尺寸排阻色谱柱。将样品装载到色谱柱上并运行色谱单元，直到如前所述洗脱所有蛋白质。
准备50微升样品用于前面所述的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。用一塔体积的双蒸馏水和一塔体积的20%乙醇在双蒸馏水中连续洗涤塔。进行蛋白质印迹分析后，合并所有含有FAHD1的馏分。
使用超离心过滤装置将蛋白质溶液的体积减少到两毫升。蛋白质印迹筛选显示上清液中存在猪FAHD1，条带为25千道尔顿，而标记的阳性对照为34千道尔顿。将裂解物中的猪FAHD1通过阴离子交换色谱纯化，并通过洗脱除结合蛋白。
通过蛋白质印迹分析鉴定含有猪FAHD1的馏分，合并并浓缩。蛋白质样品由SEC纯化并通过蛋白质印迹分析鉴定。猪FAHD1蛋白的产量约为1毫克，纯度为80%。
蛋白质印迹分析检测到小鼠FAHD1蛋白与其他蛋白质一起流出。将流通应用于尺寸排阻色谱。将含有FAHD1的馏分合并，浓缩并应用于SDS-PAGE分析。
然而，蛋白质的产量不是很高。猪FAHD1的特异性酶活性随着每总蛋白质FAHD1的相对量的增加而增加，其纯度水平随纯度水平而增加。较高浓度的硫酸铵会引起微笑效应，这种效应可以在较低的电压下解决。
进一步在裂解物和上清液中以15%的浓度发现蛋白质。然而，在较高浓度下，样品可能会沉淀并且无法检测到。这里介绍的方案要求蛋白质是可解的。
需要测试和定义沉淀和pH的最佳条件或色谱的尺寸调整。当从组织中提取蛋白质而不是从细菌中提取蛋白质时，酶功能的研究，蛋白质结构的研究和抗体的开发得到了极大的支持。
