使用基于比色细胞的测定法检测针对 AAV 的中和抗体的分步方法

先前存在的中和AAV的抗体对AAV基因疗法的进步构成了障碍。该测定是一种筛选工具，用于检测针对AAV的中和抗体。主要优点是它具有成本效益，省时性，易于设置，并且需要最少的技术技能，实验室设备和试剂。

在第一天开始接种HT1080细胞，方法是在预热的完整DMEM培养基中将细胞稀释至每毫升1×10至第五个细胞的浓度。然后将每孔100微升细胞接种到透明的96孔平底板中，浓度为每孔1×10至第四个细胞。将板在37摄氏度下与5%二氧化碳孵育过夜16至22小时。

第二天，使用预热的完整DMEM在1.5毫升微量离心管中生成目标血清样品的连续稀释液。向每个具有稀释血清样品的试管中，向每个微升病毒工作溶液中的66微升7.5x10加入66微升病毒基因组。通过移液混合病毒血清稀释液，然后将含有病毒血清混合物的管子置于37摄氏度的培养箱中，其中5%二氧化碳30分钟，以允许潜在的中和发生。

30分钟后，将100微升病毒血清混合物移液到含有每孔1x10至第四个细胞的96孔板上的每个孔中，然后将板包裹在箔中，置于37摄氏度的培养箱中，用5%二氧化碳过夜16至24小时。在第三天，使用通风橱真空从96孔板的孔中吸出培养基，而不会破坏粘附的细胞，并向每个孔中加入50微升4%多聚甲醛。用铝箔包裹板后，在室温下放置10分钟。

之后，在室温下用200微升PBS洗涤并吸出细胞两次。第二次洗涤后，将200微升预热的PBS移液到每个孔中，并将板包裹在箔中，然后在65摄氏度下孵育90分钟以变性内源性碱性磷酸酶活性，然后在50微升下将新鲜制备的溶解的BCIP / NBT孵育到每个孔中，并在室温下孵育包裹的板2至24小时。之后，在光学显微镜相机中使用4X物镜拍摄每个孔的照片，确保在所有测定中始终如一地使用相同的曝光，白平衡和光设置。

要分析 ImageJ 中的图像，请选择该文件，然后单击"打开"。对于彩色图像，请按顺序选择"图像"、"类型"和"8 位"选项卡，转换为灰度。然后转到"图像"选项卡并选择"调整"和"阈值"以更改阈值，直到所有彩色区域都变为彩色和红色，但背景不是。

单击"分析和设置测量值"，然后勾选"面积"、"面积分数"、"阈值限制"和"显示标签"复选框，OK.To 然后单击"分析和测量"，然后单击"分析和测量"，以便弹出窗口的"面积百分比"列显示信号读数。该研究通过在病毒基因组的一定浓度范围内的细胞中添加AAV6-hPLAP报告基因来确定最佳病毒剂量。15， 000的多重感染赋予36%的板着色，并被选为最佳病毒剂量。

代表性分析显示了着色与感染多样性之间的相关性。获得不影响着色与病毒浓度之间线性相关性的最高测试浓度。在对数10稀释时抗AAV6单克隆抗体或AAV6抗腺结合病毒或AAV6的中和活性的研究表明，在浓度为每毫升10纳克时，AAV6转导或TI50的抑制率为50%。

在中和抗体或NAb测定中，AAV中和程度在幼稚样品群体内变化，TI50滴度范围为1/2至1/80。测定结果表明，AAV给药前AAV抑制TI50滴度值范围为1/4至1/80。AAV给药后，TI50滴度增加到1/2000至大于1/32， 000之间，显示出AAV给药前后滴度值的明显对比。

在拍摄孔的照片时，重要的是在整个测定过程中始终使用相同的显微镜设置，并确保照片直接在孔的中心拍摄。