原子力显微镜研究活拟 南芥 根表皮细胞的物理性质

该方法允许量化发育过程中植物细胞壁物理性质的变化，并将这种微观变化与整个器官的生长联系起来。这种技术的主要优点是它不是侵入性的，并且不需要任何治疗，允许体内定量细胞壁的物理性质，增加相对快速的亚细胞分辨率。首先，用盖玻片将一层薄薄的硅胶涂入培养皿中，并将其留在空中45秒。

使用镊子将幼苗放在胶水上并定向其方向，以避免幼苗的突出部分与悬臂之间接触。然后将根部轻轻压在硅胶层上以牢固地粘合。静置 45 秒，然后添加 1X PBS 溶液。

将带有锥形尖端的标准氮化硅悬臂安装到AFM探头支架中以获取流体，并将悬臂上的激光对准靠近尖端位置。然后移动光电二极管，将激光光斑放置在探测器的中心。通过执行斜坡尺寸为 3 微米、压痕和缩回速率为 0.6 微米/秒以及触发阈值为 0.5 伏的压痕来校准偏转灵敏度。

确保探头不与样品相互作用，并校准悬臂的弹簧常数。使用热调谐实用程序，单击校准，然后单击热调谐或纳米示波器工具栏中的热调谐图标，然后输入悬臂温度。选择频率范围后，单击采样谐波振荡器流体按钮。

接下来，在热调谐面板中单击采集的数据。现在，将中值滤波器宽度调整为三。调整PSD像素宽度，通过平均并围绕第一个谐振峰值设置拟合边界来降低采集数据中的噪声。

单击"计算弹簧常数 K"，然后在弹出窗口中单击"是"，询问用户是否要使用此值。使用10、20和40倍目镜放大倍率的倒置光学显微镜，将AFM探针定位在初级根的第四个细长表皮细胞的表面上，确保将其定位在细胞的中心。使用先前计算的弹簧常数值获得的力曲线，斜坡尺寸为3微米，触发阈值为11纳牛顿，选定点的压痕和回缩率为0.6微米/秒。

从每个根的三个细胞中获取每个处理的力曲线，并为每个根捕获至少 150 条力曲线。该图显示了对位于根伸长区细胞中心的活样品进行力压痕实验时的预期结果。当AFM尖端开始缩进时，细胞壁表面的力开始增加，因为细胞壁对诽谤的反对。

力的增加会持续到达到最大力值。在此之后，压痕的卸载部分开始。力在压痕部分的抛物线之后增长，这对于将每条曲线拟合到用于计算的金字塔压头的预测模型非常重要。

作为拟合参数，接触点位置应对应于压痕前的细胞壁表面，并被视为AFM尖端位移的原点。在压痕之前无法检测到接触点的力曲线应丢弃。此外，力压痕实验的加载和卸载曲线必须没有噪声。

将每条力曲线拟合到模型后，获得直方图，显示所获得的表观杨氏模量值的频率分布。该直方图显示了在对照条件下生长的哥伦比亚零的三种不同植物的九个不同细胞上的一组 201 个成功压痕获得的频率。由于根的形态，某些基因型的压痕可能很困难。

例如，TTL 1 PRC 1-1双突变体在严重的渗透胁迫下生长。这些直方图显示了从九个不同单元格获得的表观杨氏模量值的概率分布。只有对应于一个像元的直方图 H 才能拟合到高斯分布。

这里介绍的金属可以与其他技术相结合，例如生长速率研究或细胞壁化学成分分析。这些其他技术将进一步补充信息，以了解细胞壁物理性质的化学成分如何影响器官的生长。