Diese Methode ermöglicht es, Veränderungen der physikalischen Eigenschaften der pflanzlichen Zellwand während der Entwicklung zu quantifizieren und diese mikroskopischen Veränderungen mit dem Wachstum eines ganzen Organs in Beziehung zu setzen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie nicht invasiv ist und keine Behandlung erfordert, die die In-vivo-Quantifizierung der physikalischen Eigenschaften der Zellwand ermöglicht, die subzelluläre Auflösung relativ schnell hinzuzufügen. Verteilen Sie zunächst eine dünne Schicht Silikonkleber mit einem Deckglas in die Petrischale und lassen Sie sie 45 Sekunden lang in der Luft.
Legen Sie den Sämling mit einer Pinzette auf den Kleber und richten Sie seine Richtung aus, um den Kontakt zwischen den hervorstehenden Teilen des Sämlings und dem Ausleger zu vermeiden. Drücken Sie dann die Wurzel vorsichtig auf die Silikonkleberschicht, um sie fest zu binden. Lassen Sie es 45 Sekunden stehen und fügen Sie die 1X PBS-Lösung hinzu.
Montieren Sie den Standard-Siliziumnitrid-Cantilever mit einer pyramidenförmigen Spitze in den AFM-Sondenhalter für Flüssigkeit und richten Sie den Laser auf dem Cantilever nahe an der Position der Spitze aus. Bewegen Sie dann die Fotodiode, um den Laserspot in der Mitte des Detektors zu platzieren. Kalibrieren Sie die Durchbiegungsempfindlichkeit, indem Sie eine Vertiefung mit einer Rampengröße von 3 Mikrometern, einer Eindring- und Rückzugsrate von 0,6 Mikrometern pro Sekunde und einer Triggerschwelle von 0,5 Volt durchführen.
Stellen Sie sicher, dass die Sonde nicht mit der Probe interagiert, und kalibrieren Sie die Federkonstante des Auslegers. Klicken Sie mit dem Thermal Tune-Dienstprogramm auf Kalibrieren, gefolgt von Thermal Tune oder auf das Thermal Tune-Symbol in der nano scope-Symbolleiste und geben Sie die Cantilever-Temperatur ein. Nachdem Sie einen Frequenzbereich ausgewählt haben, klicken Sie auf die Schaltfläche Sample Harmonic Oscillator Fluid.
Klicken Sie anschließend im Thermal Tune-Panel auf die erfassten Daten. Passen Sie nun die mittlere Filterbreite auf drei an. Passen Sie die PSD-Binwidth an, um das Rauschen in den erfassten Daten durch Mittelwertbildung zu reduzieren und Anpassungsgrenzen um die erste Resonanzspitze festzulegen.
Klicken Sie auf Federkonstante K berechnen und dann im Popup-Fenster auf Ja und fragen Sie, ob der Benutzer diesen Wert verwenden möchte. Positionieren Sie die AFM-Sonde mit dem inversen Lichtmikroskop bei 10-, 20- und 40-facher Okularvergrößerung auf der Oberfläche der vierten länglichen epidermalen Zelle der primären Wurzel, um sie in der Mitte der Zelle zu positionieren. Mit dem zuvor berechneten Federkonstantenwert erhält man Kraftkurven mit einer Rampengröße von 3 Mikrometern, einer Triggerschwelle von 11 Nanonewton und einer Eindring- und Rückzugsrate von 0,6 Mikrometern pro Sekunde an ausgewählten Punkten.
Erhalten Sie Kraftkurven von drei Zellen pro Wurzel für jede Behandlung und erfassen Sie mindestens 150 Kraftkurven für jede Wurzel. Dieses Diagramm zeigt ein erwartetes Ergebnis, wenn ein Krafteindringexperiment an lebenden Proben durchgeführt wird, die in der Mitte der Zelle der Wurzeldehnungszone positioniert sind. Wenn die AFM-Spitze beginnt, die Oberfläche der Zellwand einzudrücken, beginnt die Kraft aufgrund des Widerstands der Zellwand gegen die Diffamierung zuzunehmen.
Die Krafterhöhung setzt sich fort, bis der maximale Kraftwert erreicht ist. Nach diesem Punkt beginnt der Entladeteil der Vertiefung. Die Kraft wächst nach einer Parabel im Eindringteil, was wichtig ist, um jede Kurve an das Vorhersagemodell für pyramidale Eindringkörper anzupassen, das für Berechnungen verwendet wird.
Als passender Parameter sollte die Kontaktpunktposition der Zellwandoberfläche vor dem Eindringvorgang entsprechen und gilt als Ursprung der AFM-Spitzenverschiebung. Kraftkurven, in denen es unmöglich ist, den Berührungspunkt vor dem Eindruck zu erkennen, sollten verworfen werden. Außerdem muss die Be- und Entladekurve des Krafteindringversuchs geräuschfrei sein.
Nach Anpassung jeder Kraftkurve an das Modell wurden Histogramme erhalten, die die Verteilung der Häufigkeit der erhaltenen Werte des scheinbaren Elastizitätsmoduls zeigten. Dieses Histogramm zeigt die Häufigkeit, die mit einem Satz von 201 erfolgreichen Einkerbungen auf neun verschiedenen Zellen von drei verschiedenen Pflanzen von Columbia Zero erhalten wurde, die unter Kontrollbedingungen gezüchtet wurden. Die Einkerbung könnte für einige Genotypen aufgrund der Morphologie der Wurzel schwierig sein.
Zum Beispiel wuchs die TTL 1 PRC 1-1 Doppelmutante unter starkem osmotischem Stress. Diese Histogramme zeigen die Wahrscheinlichkeitsverteilung der erhaltenen Werte des scheinbaren Elastizitätsmoduls aus neun verschiedenen Zellen. Nur das Histogramm H, das einer Zelle entspricht, konnte an eine Gaußverteilung angepasst werden.
Das hier vorgestellte Metall könnte mit anderen Techniken wie Wachstumsratenstudien oder der Analyse der chemischen Zusammensetzung der Zellwand kombiniert werden. Diese anderen Techniken ergänzen die Informationen, um zu verstehen, wie die chemische Zusammensetzung der physikalischen Eigenschaften der Zellwand das Wachstum eines Organs beeinflusst.
