Este método permite quantificar as mudanças nas propriedades físicas da parede celular da planta durante o desenvolvimento e relacionar essas mudanças microscópicas com o crescimento de um órgão inteiro. A principal vantagem desta técnica é que não é invasiva e não requer nenhum tratamento que permita a quantificação in vivo das propriedades físicas da parede celular adicionar resolução subcelular relativamente rápida. Para começar, espalhe uma fina camada de cola de silicone na placa de Petri com uma tampa deslizante e deixe-a no ar por 45 segundos.
Usando uma pinça, coloque a muda na cola e oriente sua direção para evitar o contato entre as partes salientes da muda e o balanço. Em seguida, pressione a raiz suavemente na camada de cola de silicone para ligá-la firmemente. Deixe-o por 45 segundos e adicione a solução PBS 1X.
Monte o cantilever de nitreto de silício padrão com uma ponta piramidal no suporte da sonda AFM para fluido e alinhe o laser no cantilever perto da posição da ponta. Em seguida, mova o diodo da foto para colocar o ponto de laser no centro do detector. Calibre a sensibilidade de deflexão realizando um recuo com um tamanho de rampa de 3 micrômetros, uma taxa de recuo e retração de 0,6 micrômetros por segundo e um limiar de gatilho de 0,5 volts.
Certifique-se de que a sonda não está interagindo com a amostra e calibre a constante de mola do balanço. Usando o utilitário de sintonia térmica, clique em calibrar seguido de sintonia térmica ou no ícone de sintonia térmica na barra de ferramentas do nano scope e insira a temperatura do cantilever. Depois de selecionar uma faixa de frequência, clique no botão de fluido oscilador harmônico da amostra.
Em seguida, clique nos dados adquiridos no painel de sintonia térmica. Agora, ajuste a largura média do filtro para três. Ajuste a largura do compartimento PSD para reduzir o ruído nos dados adquiridos, calculando a média e defina limites de ajuste em torno do primeiro pico de ressonância.
Clique em calcular a constante de mola K e, em seguida, clique em sim na janela pop-up, perguntando se o usuário deseja usar esse valor. Usando o microscópio óptico invertido em 10, 20 e 40 vezes a ampliação da ocular, posicione a sonda AFM na superfície da quarta célula epidérmica alongada da raiz primária, certificando-a de posicioná-la no centro da célula. Com o valor constante de mola previamente calculado obteve curvas de força com um tamanho de rampa de 3 micrômetros, um limiar de gatilho de 11 nanonewton e uma taxa de recuo e retração de 0,6 micrômetros por segundo em pontos selecionados.
Obter curvas de força de três células por raiz para cada tratamento e capturar pelo menos 150 curvas de força para cada raiz. Este gráfico mostra um resultado esperado quando um experimento de recuo de força é conduzido em amostras vivas posicionadas no centro da célula da zona de alongamento radicular. Quando a ponta do AFM começa a recuar, a superfície da parede celular, a força começa a aumentar por causa da oposição da parede celular à difamação.
O aumento da força continua até que o valor máximo da força seja atingido. Após esse ponto, a parte de descarga do recuo começa. A força cresce após uma parábola na parte de recuo, que é importante para ajustar cada curva ao modelo de previsão para indenters piramidais usado para cálculos.
Como parâmetro de ajuste, a posição do ponto de contato deve corresponder à superfície da parede celular antes do recuo e é considerada a origem do deslocamento da ponta AFM. Curvas de força nas quais é impossível detectar o ponto de contato antes que o recuo seja descartado. Além disso, a curva de carga e descarga do experimento de indentação de força deve ser desprovida de ruído.
Após o ajuste de cada curva de força ao modelo, foram obtidos histogramas que mostraram a distribuição da frequência dos valores obtidos do módulo de Young aparente. Este histograma mostra a frequência obtida com um conjunto de 201 reentrâncias bem-sucedidas em nove células diferentes de três plantas diferentes de Columbia Zero cultivadas em condições de controle. A indentação pode ser difícil para alguns genótipos devido à morfologia da raiz.
Por exemplo, o duplo mutante TTL 1 PRC 1-1 cresceu em estresse osmótico grave. Estes histogramas mostram a distribuição de probabilidade dos valores obtidos do módulo de Young aparente a partir de nove células diferentes. Somente o histograma H que corresponde a uma célula poderia ser ajustado a uma distribuição gaussiana.
O metal aqui apresentado poderia ser combinado com outras técnicas, como estudos de taxa de crescimento ou análise da composição química da parede celular. Essas outras técnicas complementarão ainda mais as informações para entender como a composição química nas propriedades físicas da parede celular afeta o crescimento de um órgão.
