Questo metodo consente di quantificare i cambiamenti nelle proprietà fisiche della parete cellulare della pianta durante lo sviluppo e di correlare questi cambiamenti microscopici alla crescita di un intero organo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non è invasiva e non richiede alcun trattamento che consenta la quantificazione in vivo delle proprietà fisiche della parete cellulare e la risoluzione subcellulare relativamente rapida. Per iniziare, stendere un sottile strato di colla siliconica nella capsula di Petri con un vetrino di copertura e lasciarlo in aria per 45 secondi.
Usando una pinzetta, posiziona la piantina sulla colla e orienta la sua direzione per evitare il contatto tra le parti sporgenti della piantina e il cantilever. Quindi premere delicatamente la radice sullo strato di colla siliconica per legarlo saldamente. Lasciare agire per 45 secondi e aggiungere la soluzione PBS 1X.
Montare il cantilever standard in nitruro di silicio con una punta piramidale nel supporto della sonda AFM per il fluido e allineare il laser sul cantilever vicino alla posizione della punta. Quindi spostare il fotodiodo per posizionare il punto laser al centro del rilevatore. Calibrare la sensibilità di deflessione eseguendo una rientranza con una dimensione della rampa di 3 micrometri, una velocità di rientro e retrazione di 0,6 micrometri al secondo e una soglia di attivazione di 0,5 volt.
Assicurarsi che la sonda non interagisca con il campione e calibrare la costante della molla del cantilever . Utilizzando l'utilità di regolazione termica, fare clic su calibra seguito da sintonizzazione termica o sull'icona di regolazione termica nella barra degli strumenti del nano scope e immettere la temperatura a sbalzo. Dopo aver selezionato una gamma di frequenze, fare clic sul pulsante del fluido oscillatore armonico campione.
Quindi, fai clic sui dati acquisiti nel pannello di sintonizzazione termica. Ora, regola la larghezza mediana del filtro a tre. Regola la larghezza di binaggio PSD per ridurre il rumore nei dati acquisiti calcolando la media e imposta i limiti di adattamento intorno al primo picco di risonanza.
Fare clic su calcola costante di molla K, quindi fare clic su sì nella finestra pop-up, chiedendo se l'utente desidera utilizzare questo valore. Utilizzando il microscopio ottico invertito a 10, 20 e 40 volte l'ingrandimento dell'oculare, posizionare la sonda AFM sulla superficie della quarta cellula epidermica allungata della radice primaria assicurandosi di posizionarla al centro della cellula. Con il valore della costante della molla precedentemente calcolato si sono ottenute curve di forza con una dimensione della rampa di 3 micrometri, una soglia di innesco di 11 nanonewton e una velocità di indentazione e retrazione di 0,6 micrometri al secondo in punti selezionati.
Ottenere curve di forza da tre celle per radice per ogni trattamento e catturare almeno 150 curve di forza per ogni radice. Questo grafico mostra un risultato atteso quando un esperimento di indentazione della forza viene condotto su campioni vivi posizionati al centro della cella della zona di allungamento della radice. Quando la punta AFM inizia a rientrare, la superficie della parete cellulare, la forza inizia ad aumentare a causa dell'opposizione della parete cellulare alla diffamazione.
L'aumento della forza continua fino al raggiungimento del valore massimo della forza. Dopo questo punto, inizia la parte di scarico dell'indentazione. La forza cresce seguendo una parabola nella parte di indentazione, che è importante per adattare ogni curva al modello di previsione per i penetratori piramidali utilizzati per i calcoli.
Come parametro di adattamento, la posizione del punto di contatto deve corrispondere alla superficie della parete cellulare prima dell'indentazione ed è considerata l'origine dello spostamento della punta AFM. Curve di forza in cui è impossibile rilevare il punto di contatto prima che l'indentazione venga scartata. Inoltre, la curva di carico e scarico dell'esperimento di indentazione della forza deve essere priva di rumore.
Dopo aver adattato ogni curva di forza al modello, sono stati ottenuti istogrammi che mostravano la distribuzione della frequenza dei valori ottenuti del modulo di Young apparente. Questo istogramma mostra la frequenza ottenuta con una serie di 201 rientranze riuscite su nove diverse cellule di tre diverse piante di Columbia Zero coltivate in condizioni di controllo. L'indentazione potrebbe essere difficile per alcuni genotipi a causa della morfologia della radice.
Ad esempio, il doppio mutante TTL 1 PRC 1-1 cresciuto in grave stress osmotico. Questi istogrammi mostrano la distribuzione di probabilità dei valori ottenuti del modulo di Young apparente da nove celle diverse. Solo l'istogramma H che corrisponde a una cella potrebbe essere adattato a una distribuzione gaussiana.
Il metallo qui presentato potrebbe essere combinato con altre tecniche come studi sul tasso di crescita o analisi della composizione chimica della parete cellulare. Queste altre tecniche completeranno ulteriormente le informazioni per capire come la composizione chimica sulle proprietà fisiche della parete cellulare influenzi la crescita di un organo.
