이 방법을 사용하면 발달 중 식물 세포벽의 물리적 특성 변화를 정량화하고이 미세한 변화를 전체 장기의 성장과 관련시킬 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 침습적이지 않으며 세포벽의 물리적 특성의 생체 내 정량화가 세포 내 분해능을 비교적 빠르게 추가 할 수있는 치료가 필요하지 않다는 것입니다. 시작하려면 커버 슬립으로 페트리 접시에 실리콘 접착제의 얇은 층을 펴고 45 초 동안 공기 중에 두십시오.
핀셋을 사용하여 묘목을 접착제 위에 놓고 묘목의 튀어 나온 부분과 캔틸레버 사이의 접촉을 피하기 위해 방향을 향하게하십시오. 그런 다음 뿌리를 실리콘 접착제 층에 부드럽게 눌러 단단히 묶습니다. 45초 동안 그대로 두고 1X PBS 솔루션을 추가합니다.
피라미드 팁이 있는 표준 실리콘 질화물 캔틸레버를 유체용 AFM 프로브 홀더에 장착하고 캔틸레버의 레이저를 팁 위치에 가깝게 정렬합니다. 그런 다음 포토 다이오드를 움직여 레이저 스폿을 검출기 중앙에 배치합니다. 램프 크기가 3마이크로미터, 압입 및 수축률이 초당 0.6마이크로미터, 트리거 임계값이 0.5V인 압입 감도를 수행하여 편향 감도를 보정합니다.
프로브가 샘플과 상호 작용하지 않는지 확인하고 캔틸레버의 스프링 상수를 보정합니다. 열 조정 유틸리티를 사용하여 보정을 클릭한 다음 열 조정을 클릭하거나 나노 스코프 도구 모음의 열 조정 아이콘을 클릭하고 캔틸레버 온도를 입력합니다. 주파수 범위를 선택한 후 샘플 고조파 발진기 유체 버튼을 클릭합니다.
그런 다음 열 조정 패널에서 수집된 데이터를 클릭합니다. 이제 중앙값 필터 너비를 3으로 조정합니다. PSD binwidth를 조정하여 평균화하여 수집된 데이터의 노이즈를 줄이고 첫 번째 공진 피크 주변의 피팅 경계를 설정합니다.
스프링 상수 K 계산을 클릭 한 다음 팝업 창에서 예를 클릭하여 사용자가이 값을 사용할 것인지 묻습니다. 10, 20 및 40 배 접안 렌즈 배율의 도립 광학 현미경을 사용하여 AFM 프로브를 1 차 뿌리의 네 번째 길쭉한 표피 세포 표면에 배치하여 세포 중앙에 위치시킵니다. 이전에 계산 된 스프링 상수 값으로 3 마이크로 미터의 램프 크기, 11 나노 뉴턴의 트리거 임계 값, 선택한 지점에서 초당 0.6 마이크로 미터의 압입 및 수축 속도를 갖는 힘 곡선을 얻었습니다.
각 처리에 대해 루트당 3개의 셀에서 힘 곡선을 얻고 각 루트에 대해 최소 150개의 힘 곡선을 캡처합니다. 이 그림은 루트 신장 영역의 셀 중심에 위치한 라이브 샘플에 대해 힘 압입 실험을 수행할 때 예상되는 결과를 보여줍니다. AFM 팁이 들여쓰기를 시작하면, 세포벽의 표면이 명예훼손에 반대하기 때문에 힘이 증가하기 시작한다.
힘의 증가는 최대 힘 값에 도달할 때까지 계속됩니다. 이 시점이 지나면 들여 쓰기의 언로드 부분이 시작됩니다. 압입 부분의 포물선을 따라 힘이 증가하며, 이는 계산에 사용되는 피라미드 압자에 대한 예측 모델에 각 곡선을 맞추는 데 중요합니다.
피팅 매개 변수로서 접촉점 위치는 압입 전의 셀 벽 표면과 일치해야하며 AFM 팁 변위의 원점으로 간주됩니다. 압입 전에 접촉점을 감지 할 수없는 힘 곡선은 버려야합니다. 또한, 힘 압입 실험의 로딩 및 언로딩 곡선에는 노이즈가 없어야 합니다.
각 힘 곡선을 모델에 맞춘 후, 겉보기 영률의 얻어진 값의 빈도 분포를 보여주는 히스토그램을 얻었다. 이 히스토그램은 대조 조건에서 성장한 Columbia Zero의 3 개의 서로 다른 식물의 9 개의 다른 세포에 대해 201 개의 성공적인 들여 쓰기 세트로 얻은 빈도를 보여줍니다. 들여쓰기는 뿌리의 형태로 인해 일부 유전자형의 경우 어려울 수 있습니다.
예를 들어, TTL 1PRC 1-1 이중 돌연변이체는 심각한 삼투압 스트레스에서 성장하였다. 이 히스토그램은 9 개의 서로 다른 세포에서 얻은 겉보기 영률 값의 확률 분포를 보여줍니다. 하나의 셀에 해당하는 히스토그램 H만 가우스 분포에 맞출 수 있습니다.
여기에 제시된 금속은 성장 속도 연구 또는 세포벽의 화학적 조성 분석과 같은 다른 기술과 결합 될 수 있습니다. 이러한 다른 기술은 세포벽의 물리적 특성에 대한 화학적 조성이 장기의 성장에 어떻게 영향을 미치는지 이해하기 위해 정보를 더욱 보완합니다.
