この方法は、発生中の植物細胞壁の物理的性質の変化を定量化し、この微視的変化を器官全体の成長に関連付けることを可能にする。この技術の主な利点は、侵襲的ではなく、細胞壁の物理的特性のin vivo定量化を可能にする治療を必要とせず、細胞内分解能を比較的迅速に追加できることです。まず、シリコン接着剤の薄層をカバースリップでペトリ皿に広げ、45秒間空中に置いておきます。
ピンセットを使用して、苗を接着剤の上に置き、苗の突出した部分とカンチレバーが接触しないように方向を向けます。次に、根元をシリコーン接着剤層にそっと押し付けてしっかりと結合します。45秒間そのままにして、1X PBSソリューションを追加します。
ピラミッド型の先端を持つ標準の窒化ケイ素カンチレバーを流体用のAFMプローブホルダーに取り付け、カンチレバーのレーザーを先端の位置に近づけます。次に、フォトダイオードを動かして、検出器の中央にレーザースポットを配置します。ランプサイズ3マイクロメートル、インデントおよびリトラクションレート0.6マイクロメートル/秒、トリガーしきい値0.5ボルトのインデントを実行して、たわみ感度を調整します。
プローブがサンプルと相互作用していないことを確認し、カンチレバーのスプリング定数を校正します。サーマルチューンユーティリティを使用して、キャリブレーションをクリックしてからサーマルチューンをクリックするか、ナノスコープツールバーのサーマルチューンアイコンをクリックして、カンチレバーの温度を入力します。周波数範囲を選択したら、サンプル高調波発振器流体ボタンをクリックします。
次に、サーマルチューンパネルで取得したデータをクリックします。次に、フィルターの中央値の幅を3に調整します。PSDのビン幅を調整して、平均化して集録データのノイズを低減し、最初の共振ピークの周囲にフィット境界を設定します。
[ばね定数Kの計算]をクリックし、ポップアップウィンドウで[はい]をクリックして、ユーザーがこの値を使用するかどうかを尋ねます。接眼レンズ倍率の10倍、20倍、40倍の倒立光学顕微鏡を使用して、AFMプローブを一次根の第4の細長い表皮細胞の表面に配置して、細胞の中心に配置するようにします。以前に計算されたばね定数値を用いて、3マイクロメートルのランプサイズ、11ナノニュートンのトリガーしきい値、および選択された点で毎秒0.6マイクロメートルの圧痕および収縮率を有する力曲線を得た。
各処理について、根ごとに3つの細胞から力曲線を取得し、各根について少なくとも150の力曲線をキャプチャします。このプロットは、根の伸長ゾーンのセルの中心に位置するライブサンプルに対して力のくぼみ実験を行った場合に予想される結果を示しています。AFM先端がへこみ始めると、細胞壁の表面は、名誉毀損に対する細胞壁反対のために力が増加し始める。
力の増加は、最大力の値に達するまで続きます。この時点以降、インデントのアンロード部分が始まります。力はくぼみ部分の放物線に続いて大きくなりますが、これは計算に使用されるピラミッド型圧子の予測モデルに各曲線を当てはめるために重要です。
フィットパラメータとして、接触点の位置は圧痕前のセル壁表面に対応している必要があり、AFMチップ変位の原点と見なされます。くぼみを破棄する前に接触点を検出できない力曲線。さらに、力圧痕実験の荷重および除荷曲線にはノイズがないものでなければなりません。
各力曲線をモデルに当てはめた後、得られた見かけのヤング率の値の頻度の分布を示すヒストグラムを得た。このヒストグラムは、対照条件で成長したコロンビアゼロの3つの異なる植物の9つの異なる細胞に対する201個の成功したくぼみのセットで得られた頻度を示しています。根の形態のために、一部の遺伝子型ではインデントが難しい場合があります。
例えば、TTL1PRC 1-1二重変異体は重度の浸透圧ストレス下で増殖する。これらのヒストグラムは、9つの異なるセルから得られた見かけのヤング率の値の確率分布を示しています。1つのセルに対応するヒストグラムHのみをガウス分布に適合させることができます。
ここに提示された金属は、増殖速度の研究や細胞壁の化学組成の分析などの他の技術と組み合わせることができます。これらの他の技術は、細胞壁の物理的特性に関する化学組成が臓器の成長にどのように影響するかを理解するための情報をさらに補完します。
