Este método permite cuantificar los cambios en las propiedades físicas de la pared celular de la planta durante el desarrollo y relacionar estos cambios microscópicos con el crecimiento de todo un órgano. La principal ventaja de esta técnica es que no es invasiva y no requiere ningún tratamiento que permita la cuantificación in vivo de las propiedades físicas de la pared celular añadiendo resolución subcelular relativamente rápida. Para comenzar, extienda una capa delgada de pegamento de silicona en la placa de Petri con un cubreobjetos y déjelo en el aire durante 45 segundos.
Usando pinzas, coloque la plántula sobre el pegamento y oriente su dirección para evitar el contacto entre las partes sobresalientes de la plántula y el voladizo. Luego presione la raíz suavemente contra la capa de pegamento de silicona para unirla firmemente. Déjelo durante 45 segundos y agregue la solución 1X PBS.
Monte el voladizo de nitruro de silicio estándar con una punta piramidal en el soporte de la sonda AFM para fluido, y alinee el láser en el voladizo cerca de la posición de la punta. Luego mueva el fotodiodo para colocar el punto láser en el centro del detector. Calibre la sensibilidad a la deflexión realizando una hendidura con un tamaño de rampa de 3 micrómetros, una velocidad de indentación y retracción de 0,6 micrómetros por segundo y un umbral de disparo de 0,5 voltios.
Asegúrese de que la sonda no interactúe con la muestra y calibre la constante de resorte del voladizo. Con la utilidad de ajuste térmico, haga clic en calibrar seguido de ajuste térmico o en el icono de ajuste térmico en la barra de herramientas del nanoscopio e ingrese la temperatura en voladizo. Después de seleccionar un rango de frecuencia, haga clic en el botón del fluido oscilador armónico de muestra.
A continuación, haga clic en los datos adquiridos en el panel de ajuste térmico. Ahora, ajuste el ancho medio del filtro a tres. Ajuste el ancho de binwidth de PSD para reducir el ruido en los datos adquiridos promediando y estableciendo límites de ajuste alrededor del primer pico de resonancia.
Haga clic en calcular la constante de resorte K y luego haga clic en sí en la ventana emergente, preguntando si el usuario desea usar este valor. Usando el microscopio óptico invertido a 10, 20 y 40 veces el aumento del ocular, coloque la sonda AFM en la superficie de la cuarta célula epidérmica alargada de la raíz primaria asegurándose de colocarla en el centro de la célula. Con el valor constante de resorte calculado previamente se obtuvieron curvas de fuerza con un tamaño de rampa de 3 micrómetros, un umbral de activación de 11 nanonewton, y una tasa de indentación y retracción de 0,6 micrómetros por segundo en puntos seleccionados.
Obtenga curvas de fuerza de tres células por raíz para cada tratamiento y capture al menos 150 curvas de fuerza para cada raíz. Este gráfico muestra un resultado esperado cuando se realiza un experimento de indentación de fuerza en muestras vivas colocadas en el centro de la celda de la zona de elongación de la raíz. Cuando la punta AFM comienza a sangrar la superficie de la pared celular, la fuerza comienza a aumentar debido a la oposición de la pared celular a la difamación.
El aumento de la fuerza continúa hasta que se alcanza el valor máximo de fuerza. Después de este punto, comienza la parte de descarga de la sangría. La fuerza crece después de una parábola en la parte de indentación, que es importante para ajustar cada curva al modelo de predicción para penetradores piramidales utilizados para los cálculos.
Como parámetro de ajuste, la posición del punto de contacto debe corresponder a la superficie de la pared celular antes de la hendidura y se considera el origen del desplazamiento de la punta AFM. Las curvas de fuerza en las que es imposible detectar el punto de contacto antes de la hendidura deben descartarse. Además, la curva de carga y descarga del experimento de indentación de fuerza debe estar desprovista de ruido.
Después de ajustar cada curva de fuerza al modelo, se obtuvieron histogramas que mostraron la distribución de la frecuencia de los valores obtenidos del módulo de Young aparente. Este histograma muestra la frecuencia obtenida con un conjunto de 201 hendiduras exitosas en nueve celdas diferentes de tres plantas diferentes de Columbia Zero cultivadas en condiciones de control. La hendidura podría ser difícil para algunos genotipos debido a la morfología de la raíz.
Por ejemplo, el mutante doble TTL 1 PRC 1-1 creció en estrés osmótico severo. Estos histogramas muestran la distribución de probabilidad de los valores obtenidos del módulo de Young aparente a partir de nueve celdas diferentes. Sólo el histograma H que corresponde a una celda podría ajustarse a una distribución gaussiana.
El metal aquí presentado podría combinarse con otras técnicas como estudios de tasa de crecimiento o análisis de la composición química de la pared celular. Estas otras técnicas complementarán aún más la información para comprender cómo la composición química en las propiedades físicas de la pared celular afecta el crecimiento de un órgano.
