Con il tracciamento delle particelle sensibili alla massa, possiamo osservare singole biomolecole diffondersi sulle membrane lipidiche e quantificare le loro dinamiche in tempo reale, tutte completamente prive di etichette. Poiché non sono richieste etichette, non vi è alcun pericolo di disturbare il comportamento dinamico delle biomolecole. Un altro vantaggio di questo metodo è la sua sensibilità di massa, che ci consente di determinare gli stati oligomerici legati alla membrana.
Grazie alla sua versatilità, possiamo applicare questo metodo a qualsiasi sistema associato a membrana. In particolare, può essere utilizzato per studiare la formazione di complessi recettoriali indotti dal ligando. Inizia distribuendo un numero uguale di vetrini per microscopio nei supporti in PTFE.
Trasferire i titolari di PTFE nei becher. Aggiungere acqua ultrapura e sonicarli per 15 minuti a temperatura ambiente. Utilizzare una pinzetta per trasferire i supporti per pulire i becher e aggiungere isopropanolo ultrapuro.
Sonicare di nuovo per 15 minuti, quindi sostituire nuovamente l'isopropanolo con acqua ultrapura e sonicare il becher contenente i supporti per 15 minuti. Rimuovere i supporti dai becher e asciugare i vetrini del microscopio nel supporto sotto un flusso costante di azoto gassoso o aria compressa. Posizionare il supporto essiccato contenente i grandi vetrini del microscopio nel detergente al plasma e accenderlo.
Avvolgere il cartone piatto con un foglio di alluminio. Distribuire i vetrini per microscopio puliti da 24 millimetri per 24 millimetri sul foglio di alluminio con una distanza sufficiente l'uno dall'altro. Quindi attaccare strisce di nastro biadesivo ai bordi superiore e inferiore delle diapositive.
Asportare ogni vetrino del microscopio con un bisturi in modo tale che possa essere rimosso dal foglio di alluminio. Ogni diapositiva dovrebbe avere strisce di nastro biadesivo attaccate ai bordi superiore e inferiore della diapositiva. Quindi collegare la diapositiva con le due strisce di nastro biadesivo alla diapositiva idrofilizzata.
Questo formerà un percorso di flusso tra i vetrini del microscopio più piccoli e più grandi. Diluire le piccole vescicole unilamellari appena estruse, o SUV, fino a una concentrazione finale di 0,4 milligrammi per millilitro nel tampone di reazione richiesto. Facoltativamente, per promuovere la rottura della vescicola, aggiungere due cloruro di calcio millimolare alla sospensione della vescicola.
Montare una camera di flusso sullo stadio del fotometro di massa. Lavare 25 microlitri della sospensione delle vescicole nella camera di flusso e incubare la camera per due minuti, quindi rimuovere le vescicole non fuse attraverso il lavaggio ripetuto della camera di flusso con 200 microlitri del tampone di reazione ogni volta. Una volta che la membrana lipidica è priva di vescicole non fuse, aggiungere 50 microlitri della proteina di interesse alla camera del campione.
Impostare quindi le condizioni di imaging come la dimensione del campo visivo, il tempo di esposizione, la frequenza dei fotogrammi e il tempo di acquisizione nel software di acquisizione. Regola automaticamente la messa a fuoco. Se necessario, utilizzare il controllo laterale per spostare il campo visivo in una posizione con una membrana omogenea.
Creare una cartella di progetto e iniziare a registrare il filmato. Dopo aver completato la registrazione, specificare un nome di file nella finestra di dialogo richiesta dal software di acquisizione. Il filmato verrà salvato automaticamente nella cartella del progetto come file MP per la successiva analisi.
Per analizzare i video registrati, avviare l'app notebook Jupyter. Nell'elenco delle cartelle visualizzato, passare al percorso in cui si trova l'analisi MSPT. ipy notebook file è memorizzato e fare clic sul file.
Nei notebook Jupyter, il codice è organizzato in celle e può essere eseguito passo dopo passo. Fare clic sul piccolo pulsante Riproduci accanto alla cella o selezionare una cella e premere Maiusc Invio per eseguire la cella. Inizia importando tutti i pacchetti necessari per l'analisi.
Eseguire la cella successiva per avviare un prompt di file. Scegli una cartella contenente uno o più file video MP da analizzare e premi Seleziona cartella. Un elenco dei file scelti viene stampato sotto la cella.
Per rimuovere la dispersione statica dominante della luce con l'algoritmo di stima dello sfondo in termini di pixel, scegliere l'opzione mediana continua per la modalità parametro e impostare una lunghezza appropriata per la finestra mediana scorrevole. Facoltativamente, salvate i filmati dopo la rimozione dello sfondo impostando save_processed_movies True per utilizzarli per il rilevamento delle particelle e il collegamento della traiettoria. Assicurarsi di impostare True e GPU False paralleli per l'elaborazione sulla CPU o viceversa per l'elaborazione su una GPU.
Le particelle e la loro rispettiva posizione sono identificate e localizzate in tutto il film. Regolare la sensibilità del rilevamento delle particelle con un parametro di soglia che viene utilizzato per evidenziare i punti candidati mediante binarizzazione dell'immagine. Esaminate l'effetto dei diversi parametri di soglia sulla sensibilità di rilevamento spot in un blocco appunti separato denominato Visualizzazione filmato.
ipy notebook. Dopo aver caricato il filmato nel visualizzatore di fotogrammi, utilizzare il dispositivo di scorrimento della soglia per regolare la soglia di rilevamento delle particelle e trovare un'impostazione appropriata. Tornando all'altro notebook, scegliere tre parametri per collegare particelle in fotogrammi consecutivi in traiettorie utilizzando il trackpy del pacchetto Python.
Impostare lo spostamento massimo delle particelle da un fotogramma all'altro in base alla velocità di diffusione massima prevista. Selezionare il numero massimo di fotogrammi che una particella può svanire e riapparire ma essere comunque considerata la stessa particella. Le traiettorie con troppo pochi punti possono essere rimosse utilizzando il parametro minimum_trajectory_length per una determinazione più robusta dei coefficienti di diffusione.
Correggere tutti i parametri nella cella eseguendola. Esegui la cella successiva per analizzare tutti i video selezionati con i parametri scelti. Le barre di avanzamento per ogni fase di elaborazione verranno visualizzate sotto la cella.
Questa operazione potrebbe richiedere del tempo, a seconda della lunghezza del video, delle impostazioni dei parametri e dell'hardware. Nella fase successiva il software determina i coefficienti di diffusione per le traiettorie trovate nella sezione precedente, in base sia alla distribuzione della distanza di salto che all'analisi dello spostamento quadrato medio. Inizia specificando il filmato frame_rate e pixel_size.
Correggili eseguendo la cella, quindi esegui la cella successiva e seleziona la directory padre contenente tutti i file CSV generati da trackpy. Un elenco dei file CSV trovati viene stampato sotto la cella. Nella cella successiva scegliere un nome per il contenitore HDF5 in cui sono archiviati i risultati ed eseguirlo.
Infine eseguire la cella C.4 per eseguire l'analisi di diffusione. Nella cella C.5 inserire il contrasto con i parametri della linea di calibrazione della massa, il che significa la pendenza e l'offset determinati utilizzando campioni di massa nota ed eseguirlo per convertire tutti i contrasti delle particelle nella massa molecolare. Valutare la densità apparente delle particelle sulla membrana eseguendo la cella C.6, che restituisce il valore di densità mediana in termini di particelle rilevate e traiettorie presenti durante ogni fotogramma come colonne aggiuntive nel frame di dati.
Per generare il grafico finale per la correlazione tra massa e coefficiente di diffusione, eseguire la cella D.1 per caricare un prompt di file e specificare il file HDF5 contenente i risultati MSPT, quindi selezionare il set di dati da un singolo video da tracciare nella cella D.2 o combinare i dati di più video in un singolo fotogramma di dati eseguendo la cella D.3. In questo esempio, poiché tutti i video sono repliche di campioni identici, il set di dati viene raggruppato. Infine traccia la densità del kernel 2D eseguendo la cella D.4.
Se soddisfatto, specificare una posizione in cui salvare il plottaggio in un file PDF nella cella D.5 ed eseguirlo. Qui sono mostrate immagini rappresentative della rugosità superficiale di un vetrino di copertura durante la formazione di un doppio strato lipidico supportato, con un doppio strato lipidico supportato intatto, e di proteine esemplari ricostituite su un SLB. Tutti e quattro gli esempi vengono visualizzati in modalità nativa, a cui è possibile accedere durante la misurazione stessa, e come immagini ratiometriche elaborate dopo la rimozione dello sfondo basato sulla mediana.
Una calibrazione che traduce il contrasto in massa molecolare può essere ottenuta attaccando biomolecole di massa nota a un SLB tramite un complesso biotina-streptavidina-biotina. Come strategia esemplare, si possono usare varianti biotinilate di albumina sierica bovina, proteina A, fosfatasi alcalina e fibronectina che si legano alla streptavidina che a sua volta è legata ai lipidi contenenti biotina nella membrana. Il contrasto sempre più pronunciato di queste macromolecole esemplari riflette il crescente peso molecolare dei rispettivi standard biotinilati.
Assegnando ogni picco degli istogrammi di contrasto alla massa corrispondente dello stato oligomerico della proteina standard, viene rivelata una relazione lineare tra contrasto e massa e può essere successivamente utilizzata per l'analisi di sistemi macromolecolari sconosciuti. Le stime 2D della densità del kernel sia del coefficiente di massa che di diffusione della streptavidina tetravalente in complesso con aldolasi biotinilata o con un anticorpo anti-rabbit IgG di capra modificato con biotina sono mostrate qui. Le immagini rappresentative mostrano un confronto tra masse oligomeriche determinate per il complesso di streptavidina tetravalente con aldolasi o IgG modificate con biotina e pesi molecolari attesi.
Con MSPT, possiamo tracciare le biomolecole direttamente sulle membrane lipidiche, determinare quale massa hanno, come si muovono e come interagiscono. Sono fiducioso che questa tecnica trasformerà la nostra comprensione dei processi biologici su e con le membrane.
