באמצעות מעקב אחר חלקיקים רגישים למסה, אנו יכולים לראות ביו-מולקולות בודדות מתפזרות על ממברנות השומנים ולכמת את הדינמיקה שלהן בזמן אמת, כולן ללא תווית לחלוטין. מכיוון שאין צורך בתוויות, אין סכנה להפריע להתנהגות הדינמית של הביומולקולות. יתרון נוסף של שיטה זו הוא רגישות המסה שלה, המאפשרת לנו לקבוע מצבים אוליגומריים הקשורים לממברנה.
בשל הרבגוניות שלה, אנו יכולים ליישם שיטה זו על כל מערכת הקשורה לממברנה. בפרט, ניתן להשתמש בו כדי לחקור את היווצרותם של קומפלקסים של קולטנים המושרים על ידי ליגנד. התחל על ידי הפצת מספר שווה של שקופיות מיקרוסקופ במחזיקי PTFE.
העבר את מחזיקי ה- PTFE לכוסות. הוסיפו מים אולטרה-פוריים והקדישו אותם ל-15 דקות בטמפרטורת החדר. השתמש בפינצטה כדי להעביר את המחזיקים כדי לנקות את הכוסות ולהוסיף איזופרופנול אולטרה-פורה.
סוניקט שוב במשך 15 דקות, ואז שוב להחליף את האיזופרופנול במים אולטרה-אפורים, ולהצליל את הכוס המכילה את המחזיקים במשך 15 דקות. הסר את המחזיקים מהכוסות וייבש את החלקות המיקרוסקופיות במחזיק תחת זרם קבוע של גז חנקן או אוויר דחוס. מניחים את המחזיק המיובש המכיל את שקופיות המיקרוסקופ הגדולות לתוך מנקה הפלזמה ומפעילים אותו.
עוטפים את הקרטון השטוח בנייר אלומיניום. פרשו את 24 המילימטרים המנוקים על ידי 24 מילימטרים שקופיות מיקרוסקופ על רדיד האלומיניום עם מרחק מספיק זה מזה. לאחר מכן חברו רצועות סרט דו-צדדיות לקצוות העליונים והתחתונים של השקופיות.
בלו כל שקופית מיקרוסקופ עם אזמל כך שניתן יהיה להסיר אותו מנייר האלומיניום. כל שקופית צריכה לכלול פסים של סרט הדבקה דו-צדדי המחוברים לקצוות העליונים והתחתונים של השקופית. לאחר מכן חברו את המגלשה עם שתי רצועות הטייפ הדו-צדדיות לשקופית ההידרופילית.
זה ייצור נתיב זרימה בין שקופיות המיקרוסקופ הקטנות והגדולות יותר. דיללו את הבועיות החד-שכבתיות הקטנות שזה עתה הוצאו, או רכבי שטח, לריכוז סופי של 0.4 מיליגרם למיליליטר במאגר התגובה הנדרש. לחלופין, כדי לקדם קרע שלפוחית, להוסיף שני מילימולרי סידן כלורי לתרחיף השלפוחית.
הרכיבו תא זרימה על במת הפוטומטר של המסה. יש לשטוף 25 מיקרוליטרים של תרחיף השלפוחית לתוך תא הזרימה ולדגום את התא במשך שתי דקות, ואז להסיר את הבועיות הלא מרוסנות באמצעות שטיפה חוזרת ונשנית של תא הזרימה עם 200 מיקרוליטרים של מאגר התגובה בכל פעם. לאחר שקרום השומנים נקי משלפוחיות לא משולבות, הוסף 50 מיקרוליטרים של החלבון המעניין לתא הדגימה.
לאחר מכן הגדר את תנאי ההדמיה כגון גודל שדה הראייה, זמן החשיפה, קצב הפריימים וזמן הרכישה בתוכנת הרכישה. התאם את המיקוד באופן אוטומטי. במידת הצורך השתמש בבקרה הצידית כדי להזיז את שדה הראייה למצב עם קרום הומוגני.
צור תיקיית פרוייקט והתחל להקליט את הסרט. לאחר השלמת ההקלטה, ציין שם קובץ בדיאלוג שהתבקש על ידי תוכנת הרכישה. הסרט יישמר באופן אוטומטי בתיקיית הפרויקט כקובץ MP לניתוח מאוחר יותר.
כדי לנתח את הסרטונים המוקלטים, הפעל את אפליקציית המחברת Jupyter. ברשימת התיקיות המופיעות, נווט אל המיקום שבו ניתוח MSPT. קובץ מחברת IPy מאוחסן ולחץ על הקובץ.
במחברות Jupyter, הקוד מאורגן בתאים וניתן לבצע אותו צעד אחר צעד. לחץ על לחצן ההפעלה הקטן שליד התא או בחר תא ולחץ על Shift Enter כדי להפעיל את התא. התחל על ידי ייבוא כל החבילות הנדרשות לניתוח.
הפעל את התא הבא כדי להפעיל שורת קובץ. בחר תיקיה המכילה קובץ וידאו MP אחד או יותר לניתוח והקש בחר תיקיה. רשימה של הקבצים שנבחרו מודפסת מתחת לתא.
כדי להסיר את הפיזור הסטטי הדומיננטי של האור באמצעות אלגוריתם הערכת הרקע מבחינת פיקסלים, בחר באפשרות החציון הרציף עבור מצב הפרמטר והגדר אורך מתאים לחלון החציון הזזה. לחלופין, שמור את הסרטים לאחר הסרת הרקע על ידי הגדרת save_processed_movies True לשימוש בהם לזיהוי חלקיקים וקישור מסלול. הקפד להגדיר True ו- GPU False מקבילים לעיבוד ב- CPU או להיפך לעיבוד ב- GPU.
החלקיקים והמיקום שלהם בהתאמה מזוהים ומתואמים לאורך כל הסרט. כוונו את הרגישות של זיהוי החלקיקים עם פרמטר סף המשמש להדגשת הכתמים המועמדים על ידי בינאריזציה של התמונה. בחן את ההשפעה של פרמטרי סף משתנים על רגישות הזיהוי הנקודתי במחברת נפרדת הנקראת הדמיית סרט.
מחברת ipy. לאחר טעינת הסרט למציג המסגרות השתמש במחוון הסף כדי להתאים את סף זיהוי החלקיקים ולמצוא הגדרה מתאימה. בחזרה למחברת השנייה, בחר שלושה פרמטרים לקישור חלקיקים במסגרות עוקבות למסלולים באמצעות trackpy חבילת Python.
הגדר את התזוזה המרבית של חלקיקים ממסגרת אחת לאחרת בהתאם למהירות הדיפוזיה המרבית הצפויה. בחר את המספר המרבי של מסגרות שחלקיק עשוי להיעלם ולהופיע שוב, אך עדיין להיחשב לאותו חלקיק. מסלולים עם מעט מדי נקודות עשויים להיות מוסרים באמצעות הפרמטר minimum_trajectory_length לקביעה חזקה יותר של מקדמי הדיפוזיה.
תקן את כל הפרמטרים בתא על-ידי ביצועו. הפעל את התא הבא כדי לנתח את כל הסרטונים שנבחרו עם הפרמטרים שנבחרו. פסי התקדמות עבור כל שלב עיבוד יופיעו מתחת לתא.
פעולה זו עשויה להימשך זמן מה, בהתאם לאורך הווידאו, הגדרות הפרמטרים והחומרה. בשלב הבא התוכנה קובעת את מקדמי הדיפוזיה עבור המסלולים שנמצאו בסעיף הקודם, בהתבסס הן על התפלגות מרחק הקפיצה והן על ניתוח תזוזה ריבועית ממוצעת. התחל על ידי ציון frame_rate הסרט pixel_size.
תקן אותם על-ידי הפעלת התא ולאחר מכן הפעל את התא הבא ובחר את ספריית האב המכילה את כל קבצי ה- CSV שנוצרו על-ידי trackpy. רשימה של קבצי ה- CSV שנמצאו מודפסת מתחת לתא. בתא הבא בחר שם למיכל HDF5 שבו מאוחסנות התוצאות והפעל אותו.
לבסוף לבצע את תא C.4 כדי לבצע את ניתוח הדיפוזיה. בתא C.5 הזן את הניגודיות לפרמטרים של קו כיול המסה, כלומר השיפוע וההיסט נקבעים באמצעות דגימות בעלות מסה ידועה ומבצעים אותה כדי להמיר את כל ניגודי החלקיקים למסה המולקולרית. הערך את צפיפות החלקיקים לכאורה על הממברנה על ידי ביצוע תא C.6, המחזיר את ערך הצפיפות החציונית במונחים של חלקיקים שזוהו ומציג מסלולים במהלך כל מסגרת כעמודות נוספות במסגרת הנתונים.
כדי ליצור את העלילה הסופית עבור המתאם של מקדם מסה ודיפוזיה, בצע את תא D.1 כדי לטעון שורת קובץ וציין את קובץ HDF5 המכיל את תוצאות MSPT, ולאחר מכן בחר את ערכת הנתונים מסרטון יחיד כדי להתוות בתא D.2 או שלב את הנתונים מסרטונים מרובים למסגרת נתונים אחת על-ידי הפעלת התא D.3. בדוגמה זו, מכיוון שכל הסרטונים הם העתקים של דגימות זהות, ערכת הנתונים מאוגדת. לבסוף התווה את צפיפות הליבה הדו-ממדית על-ידי ביצוע התא D.4.
אם אתה מרוצה, ציין מיקום לשמירת העלילה בקובץ PDF בתא D.5 והפעל אותה. תמונות מייצגות של חספוס פני השטח של מגלשת כיסוי זכוכית במהלך היווצרותו של דו-שכבת שומנים נתמכת, עם דו-שכבת שומנים נתמכת שלם, ושל חלבונים מופתיים המשוחזרים על SLB מוצגות כאן. כל ארבע הדוגמאות מוצגות במצב המקורי, שניתן לגשת אליו במהלך המדידה עצמה, וכתמונות יחסמטריות מעובדות לאחר הסרת רקע מבוססת חציון.
כיול המתרגם ניגודיות למסה מולקולרית יכול להיות מושג על ידי הצמדת ביומולקולות בעלות מסה ידועה ל-SLB באמצעות קומפלקס ביוטין-סטרפטווידין-ביוטין-ביוטין. כאסטרטגיה למופת, ניתן להשתמש בגרסאות ביוטינילציה של אלבומין בסרום בקר, חלבון A, פוספטאז אלקליין ופיברונקטין הנקשרים לסטרפטווידין שבעצמו קשור לליפידים המכילים ביוטין בממברנה. הניגודיות ההולכת וגדלה של מקרומולקולות מופתיות אלה משקפת את המשקל המולקולרי ההולך וגדל של התקנים הביוטינילטיביים המתאימים.
על ידי הקצאת כל שיא של היסטוגרמות הניגודיות למסה המתאימה של מצב האוליגומר של החלבון הסטנדרטי, מתגלה קשר ליניארי בין ניגודיות למסה וניתן להשתמש בו לאחר מכן לניתוח של מערכות מקרומולקולות לא ידועות. הערכות צפיפות גרעינים דו-ממדיות של מקדם מסה ודיפוזיה של מקדם סטרפטווידין טטרוולנטי בקומפלקס עם אלדולאז ביוטינילציה או עם נוגדן IgG נגד ארנב עזים שעבר שינוי ביוטין מוצגות כאן. התמונות הייצוגיות מראות השוואה של מסות אוליגומרים נחושות עבור הקומפלקס של סטרפטווידין טטרוולנטי עם אלדולאז או IgG שעברו שינוי ביוטין ומשקלים מולקולריים צפויים.
בעזרת MSPT, אנו יכולים לעקוב אחר ביומולקולות ישירות על ממברנות השומנים, לקבוע איזו מסה יש להם, כיצד הם נעים וכיצד הם מתקשרים. אני סמוך ובטוח שטכניקה זו תשנה את הבנתנו לגבי תהליכים ביולוגיים על ממברנות ועם ממברנות.
