Grâce au suivi des particules sensibles à la masse, nous pouvons observer la diffusion de biomolécules individuelles sur les membranes lipidiques et quantifier leur dynamique en temps réel, le tout sans étiquette. Comme aucune étiquette n’est requise, il n’y a aucun risque de perturber le comportement dynamique des biomolécules. Un autre avantage de cette méthode est sa sensibilité à la masse, qui nous permet de déterminer les états oligomères liés à la membrane.
En raison de sa polyvalence, nous pouvons appliquer cette méthode à n’importe quel système associé à la membrane. En particulier, il peut être utilisé pour étudier la formation de complexes de récepteurs induits par des ligands. Commencez par distribuer un nombre égal de lames de microscope dans des supports en PTFE.
Transférez les supports en PTFE dans les béchers. Ajouter de l’eau ultrapure et les soniquer pendant 15 minutes à température ambiante. Utilisez une pince à épiler pour transférer les supports sur les béchers propres et ajoutez de l’isopropanol ultrapur.
Sonicate à nouveau pendant 15 minutes, puis remplacez à nouveau l’isopropanol par de l’eau ultrapure et soniquez le bécher contenant les supports pendant 15 minutes. Retirez les supports des béchers et séchez les lames de microscope dans le support sous un flux constant d’azote gazeux ou d’air comprimé. Placez le support séché contenant les grandes lames de microscope dans le nettoyeur plasma et allumez-le.
Enveloppez le carton plat avec du papier d’aluminium. Étalez les lames de microscope nettoyées de 24 millimètres par 24 millimètres sur la feuille d’aluminium avec une distance suffisante entre elles. Fixez ensuite des bandes de ruban adhésif double face aux bords supérieur et inférieur des glissières.
Retirez chaque lame de microscope d’un scalpel de sorte qu’elle puisse être retirée de la feuille d’aluminium. Chaque diapositive doit avoir des bandes de ruban adhésif double face attachées aux bords supérieur et inférieur de la diapositive. Fixez ensuite la glissière avec les deux bandes de ruban adhésif double face à la lame hydrophilisée.
Cela formera un chemin d’écoulement entre les plus petites et les plus grandes lames de microscope. Diluer les petites vésicules unilamellaires fraîchement extrudées, ou VUS, à une concentration finale de 0,4 milligramme par millilitre dans le tampon de réaction requis. Éventuellement, pour favoriser la rupture des vésicules, ajouter deux millimolaires de chlorure de calcium à la suspension de la vésicule.
Montez une chambre d’écoulement sur l’étage du photomètre de masse. Rincez 25 microlitres de la suspension de vésicule dans la chambre d’écoulement et incubez la chambre pendant deux minutes, puis retirez les vésicules non fusionnées par lavage répété de la chambre d’écoulement avec 200 microlitres du tampon de réaction à chaque fois. Une fois que la membrane lipidique est exempte de vésicules non fusionnées, ajoutez 50 microlitres de la protéine d’intérêt à la chambre d’échantillonnage.
Définissez ensuite les conditions d’imagerie telles que la taille du champ de vision, le temps d’exposition, la fréquence d’images et le temps d’acquisition dans le logiciel d’acquisition. Ajustez la mise au point automatiquement. Si nécessaire, utilisez la commande latérale pour déplacer le champ de vision dans une position avec une membrane homogène.
Créez un dossier de projet et commencez à enregistrer le film. Une fois l’enregistrement terminé, spécifiez un nom de fichier dans la boîte de dialogue déclenchée par le logiciel d’acquisition. Le film sera automatiquement enregistré dans le dossier du projet en tant que fichier MP pour une analyse ultérieure.
Pour analyser les vidéos enregistrées, lancez l’application jupyter notebook. Dans la liste des dossiers qui s’affiche, accédez à l’emplacement où se trouve l’analyse MSPT. Le fichier de bloc-notes ipy est stocké et cliquez sur le fichier.
Dans les blocs-notes Jupyter, le code est organisé en cellules et peut être exécuté étape par étape. Cliquez sur le petit bouton Lecture à côté de la cellule ou sélectionnez une cellule et appuyez sur Maj Entrée pour exécuter la cellule. Commencez par importer tous les packages requis pour l’analyse.
Exécutez la cellule suivante pour lancer une invite de fichier. Choisissez un dossier contenant un ou plusieurs fichiers vidéo MP à analyser et appuyez sur Sélectionner un dossier. Une liste des fichiers choisis est imprimée sous la cellule.
Pour supprimer la diffusion statique dominante de la lumière à l’aide de l’algorithme d’estimation d’arrière-plan par pixel, choisissez l’option médiane continue pour le mode paramètre et définissez une longueur appropriée pour la fenêtre médiane coulissante. Si vous le souhaitez, enregistrez les films après la suppression de l’arrière-plan en définissant save_processed_movies True pour les utiliser pour la détection de particules et la liaison de trajectoire. Assurez-vous de définir parallèlement True et GPU False pour le traitement sur le CPU ou vice versa pour le traitement sur un GPU.
Les particules et leur position respective sont identifiées et localisées tout au long du film. Réglez la sensibilité de la détection de particules avec un paramètre de seuil qui est utilisé pour mettre en évidence les points candidats par binarisation d’image. Examinez l’effet de la variation des paramètres de seuil sur la sensibilité de détection ponctuelle dans un bloc-notes distinct appelé Visualisation vidéo.
ipy notebook. Après avoir chargé le film dans la visionneuse d’images, utilisez le curseur de seuil pour ajuster le seuil de détection de particules et trouver un paramètre approprié. De retour à l’autre bloc-notes, choisissez trois paramètres pour lier des particules dans des images consécutives dans des trajectoires à l’aide du package Python trackpy.
Définissez le déplacement maximal des particules d’une image à l’autre en fonction de la vitesse de diffusion maximale attendue. Sélectionnez le nombre maximal d’images qu’une particule peut disparaître et réapparaître tout en étant considérée comme la même particule. Les trajectoires avec trop peu de points peuvent être supprimées en utilisant le paramètre minimum_trajectory_length pour une détermination plus robuste des coefficients de diffusion.
Corrigez tous les paramètres de la cellule en l’exécutant. Exécutez la cellule suivante pour analyser toutes les vidéos sélectionnées avec les paramètres choisis. Des barres de progression pour chaque étape de traitement apparaîtront sous la cellule.
Cela peut prendre un certain temps, en fonction de la durée de la vidéo, des paramètres et du matériel. Dans l’étape suivante, le logiciel détermine les coefficients de diffusion des trajectoires trouvées dans la section précédente, en fonction de la distribution de la distance de saut et de l’analyse du déplacement carré moyen. Commencez par spécifier la frame_rate et la pixel_size du film.
Corrigez-les en exécutant la cellule, puis exécutez la cellule suivante et sélectionnez le répertoire parent contenant tous les fichiers CSV générés par trackpy. Une liste des fichiers CSV trouvés est imprimée sous la cellule. Dans la cellule suivante, choisissez un nom pour le conteneur HDF5 où les résultats sont stockés et exécutez-le.
Enfin, exécutez la cellule C.4 pour effectuer l’analyse de diffusion. Dans la cellule C.5, entrez le contraste avec les paramètres de la ligne d’étalonnage de masse, ce qui signifie la pente et le décalage déterminés à l’aide d’échantillons de masse connue et exécutez-le pour convertir tous les contrastes de particules en masse moléculaire. Évaluez la densité apparente des particules sur la membrane en exécutant la cellule C.6, qui renvoie la valeur de densité médiane en termes de particules détectées et présente les trajectoires au cours de chaque image sous forme de colonnes supplémentaires dans la base de données.
Pour générer le tracé final de la corrélation entre la masse et le coefficient de diffusion, exécutez la cellule D.1 pour charger une invite de fichier et spécifiez le fichier HDF5 contenant les résultats MSPT, puis sélectionnez l’ensemble de données d’une seule vidéo pour tracer dans la cellule D.2 ou combinez les données de plusieurs vidéos en une seule image de données en exécutant la cellule D.3. Dans cet exemple, étant donné que toutes les vidéos sont des répliques d’échantillons identiques, l’ensemble de données est regroupé. Enfin, tracez la densité du noyau 2D en exécutant la cellule D.4.
Si vous êtes satisfait, spécifiez un emplacement pour enregistrer le tracé dans un fichier PDF dans la cellule D.5 et exécutez-le. Des images représentatives de la rugosité de surface d’une lame de couverture de verre lors de la formation d’une bicouche lipidique supportée, avec une bicouche lipidique soutenue intacte, et de protéines exemplaires reconstituées sur un SLB sont présentées ici. Les quatre exemples sont affichés en mode natif, auquel on peut accéder pendant la mesure elle-même, et en tant qu’images ratiométriques traitées après suppression de l’arrière-plan basée sur la médiane.
Un étalonnage qui traduit le contraste en masse moléculaire peut être réalisé en attachant des biomolécules de masse connue à un SLB via un complexe biotine-streptavidine-biotine. Comme stratégie exemplaire, on peut utiliser des variantes biotinylées de l’albumine sérique bovine, de la protéine A, de la phosphatase alcaline et de la fibronectine qui se lient à la streptavidine qui est elle-même liée aux lipides contenant de la biotine dans la membrane. Le contraste de plus en plus prononcé de ces macromolécules exemplaires reflète le poids moléculaire croissant des étalons biotinylés respectifs.
En attribuant chaque pic des histogrammes de contraste à la masse correspondante de l’état oligomère de la protéine standard, une relation linéaire entre le contraste et la masse est révélée et peut ensuite être utilisée pour l’analyse de systèmes de macromolécules inconnus. Les estimations 2D de la densité du noyau de la masse et du coefficient de diffusion de la streptavidine tétravalente en complexe avec de l’aldolase biotinylée ou avec un anticorps IgG de chèvre modifié par la biotine sont présentées ici. Les images représentatives montrent une comparaison des masses oligomères déterminées pour le complexe de streptavidine tétravalente avec l’aldolase ou IgG modifiée par la biotine et les poids moléculaires attendus.
Avec MSPT, nous pouvons suivre les biomolécules directement sur les membranes lipidiques, déterminer leur masse, leur déplacement et leur interaction. Je suis convaincu que cette technique transformera notre compréhension des processus biologiques sur et avec les membranes.
