Mit dem massensensitiven Partikel-Tracking können wir einzelne Biomoleküle beobachten, die auf Lipidmembranen diffundieren und ihre Dynamik in Echtzeit quantifizieren, alles völlig markierungsfrei. Da keine Markierungen erforderlich sind, besteht keine Gefahr, das dynamische Verhalten der Biomoleküle zu stören. Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist ihre Massenempfindlichkeit, die es uns ermöglicht, membrangebundene oligomere Zustände zu bestimmen.
Aufgrund seiner Vielseitigkeit können wir diese Methode auf jedes membranassoziierte System anwenden. Insbesondere kann es verwendet werden, um die Bildung von Liganden-induzierten Rezeptorkomplexen zu untersuchen. Beginnen Sie mit der Verteilung einer gleichen Anzahl von Objektträgern in PTFE-Haltern.
Übertragen Sie die PTFE-Halter in die Bechergläser. Fügen Sie Reinstwasser hinzu und beschallen Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Halter auf saubere Becher zu übertragen und ultrareines Isopropanol hinzuzufügen.
Beschallen Sie erneut für 15 Minuten, ersetzen Sie dann erneut das Isopropanol durch Reinstwasser und beschallen Sie das Becherglas mit den Haltern für 15 Minuten. Entfernen Sie die Halter aus den Bechergläsern und föhnen Sie die Objektträger in der Halterung unter einem stetigen Strom von Stickstoffgas oder Druckluft. Legen Sie den getrockneten Halter mit den großen Objektträgern in den Plasmareiniger und schalten Sie ihn ein.
Wickeln Sie den flachen Karton mit Aluminiumfolie ein. Verteilen Sie die gereinigten 24 Millimeter mal 24 Millimeter großen Objektträger mit ausreichendem Abstand zueinander auf der Aluminiumfolie. Befestigen Sie dann doppelseitige Klebestreifen an den oberen und unteren Rändern der Objektträger.
Schneiden Sie jeden Objektträger mit einem Skalpell aus, so dass er von der Aluminiumfolie entfernt werden kann. Jedes Dia sollte Streifen aus doppelseitigem Klebeband aufweisen, die an den oberen und unteren Rändern des Objektträgers angebracht sind. Befestigen Sie dann das Dia mit den beiden doppelseitigen Bandstreifen an dem hydrophilisierten Objektträger.
Dadurch bildet sich ein Fließpfad zwischen den kleineren und größeren Objektträgern. Verdünnen Sie die frisch extrudierten kleinen unilamellären Vesikel (SUVs) im erforderlichen Reaktionspuffer auf eine Endkonzentration von 0,4 Milligramm pro Milliliter. Optional, um die Vesikelruptur zu fördern, fügen Sie der Vesikelsuspension zwei millimolare Calciumchloride hinzu.
Montieren Sie eine Durchflusskammer auf der Massenphotometerstufe. Spülen Sie 25 Mikroliter der Vesikelsuspension in die Durchflusskammer und inkubieren Sie die Kammer für zwei Minuten, dann entfernen Sie die unverschmolzenen Vesikel durch wiederholtes Waschen der Durchflusskammer mit jeweils 200 Mikrolitern des Reaktionspuffers. Sobald die Lipidmembran frei von unverschmolzenen Vesikeln ist, fügen Sie 50 Mikroliter des interessierenden Proteins in die Probenkammer hinzu.
Als nächstes legen Sie die Bildgebungsbedingungen wie die Größe des Sichtfelds, die Belichtungszeit, die Bildrate und die Erfassungszeit in der Erfassungssoftware fest. Passen Sie den Fokus automatisch an. Verwenden Sie bei Bedarf die laterale Kontrolle, um das Sichtfeld an eine Position mit einer homogenen Membran zu bewegen.
Erstellen Sie einen Projektordner und beginnen Sie mit der Aufnahme des Films. Geben Sie nach Abschluss der Aufzeichnung einen Dateinamen in dem von der Erfassungssoftware angeforderten Dialog an. Der Film wird automatisch als MP-Datei zur späteren Analyse im Projektordner gespeichert.
Um die aufgezeichneten Videos zu analysieren, starten Sie die Jupyter-Notebook-App. Navigieren Sie in der angezeigten Ordnerliste zu dem Speicherort, an dem sich die MSPT-Analyse befindet. Die IPY-Notebook-Datei wird gespeichert und klicken Sie auf die Datei.
In Jupyter-Notebooks ist Code in Zellen organisiert und kann Schritt für Schritt ausgeführt werden. Klicken Sie auf die kleine Wiedergabeschaltfläche neben der Zelle oder wählen Sie eine Zelle aus und drücken Sie die Umschalttaste, um die Zelle auszuführen. Beginnen Sie mit dem Import aller für die Analyse erforderlichen Pakete.
Führen Sie die nächste Zelle aus, um eine Dateieingabeaufforderung zu starten. Wählen Sie einen Ordner aus, der eine oder mehrere zu analysierende MP-Videodateien enthält, und klicken Sie auf Ordner auswählen. Eine Liste der ausgewählten Dateien wird unter der Zelle gedruckt.
Um die dominante statische Lichtstreuung mit dem pixelweisen Hintergrundschätzungsalgorithmus zu entfernen, wählen Sie die Option für den kontinuierlichen Median für den Parametermodus und legen Sie eine geeignete Länge für das gleitende Medianfenster fest. Optional können Sie die Filme nach dem Entfernen des Hintergrunds speichern, indem Sie save_processed_movies True festlegen, um sie für die Partikelerkennung und Trajektorienverknüpfung zu verwenden. Stellen Sie sicher, dass Sie True und GPU False für die Verarbeitung auf der CPU parallel festlegen oder umgekehrt für die Verarbeitung auf einer GPU.
Partikel und ihre jeweilige Position werden im gesamten Film identifiziert und lokalisiert. Stimmen Sie die Empfindlichkeit der Partikeldetektion mit einem Schwellenwertparameter ab, der verwendet wird, um die Kandidatenflecken durch Bildbinarisierung hervorzuheben. Untersuchen Sie die Auswirkungen unterschiedlicher Schwellenwertparameter auf die Spot-Erkennungsempfindlichkeit in einem separaten Notizbuch namens Movie-Visualisierung.
IPY-Notebook. Nachdem Sie den Film in den Frame-Viewer geladen haben, verwenden Sie den Schwellenwert, um den Partikelerkennungsschwellenwert anzupassen und eine geeignete Einstellung zu finden. Zurück zum anderen Notebook: Wählen Sie drei Parameter aus, um Partikel in aufeinanderfolgenden Frames mit dem Python-Paket trackpy zu Trajektorien zu verknüpfen.
Stellen Sie die maximale Verschiebung von Partikeln von einem Frame zum nächsten entsprechend der maximal erwarteten Diffusionsgeschwindigkeit ein. Wählen Sie die maximale Anzahl von Frames aus, die ein Partikel verschwinden und wieder erscheinen kann, aber immer noch als dasselbe Partikel betrachtet wird. Trajektorien mit zu wenigen Punkten können mit dem Parameter minimum_trajectory_length für eine robustere Bestimmung der Diffusionskoeffizienten entfernt werden.
Korrigieren Sie alle Parameter in der Zelle, indem Sie sie ausführen. Führen Sie die nächste Zelle aus, um alle ausgewählten Videos mit den ausgewählten Parametern zu analysieren. Fortschrittsbalken für jeden Verarbeitungsschritt werden unter der Zelle angezeigt.
Dies kann je nach Videolänge, Parametereinstellungen und Hardware eine Weile dauern. Im nächsten Schritt bestimmt die Software die Diffusionskoeffizienten für die im vorherigen Abschnitt gefundenen Trajektorien, basierend auf der Verteilung der Sprungentfernung und der Analyse der mittleren quadratischen Verschiebung. Beginnen Sie mit der Angabe der frame_rate und pixel_size des Films.
Beheben Sie sie, indem Sie die Zelle ausführen, dann die nächste Zelle ausführen und das übergeordnete Verzeichnis auswählen, das alle von trackpy generierten CSV-Dateien enthält. Eine Liste der gefundenen CSV-Dateien ist unter der Zelle abgedruckt. Wählen Sie in der nächsten Zelle einen Namen für den HDF5-Container aus, in dem die Ergebnisse gespeichert sind, und führen Sie ihn aus.
Führen Sie schließlich Zelle C.4 aus, um die Diffusionsanalyse durchzuführen. Geben Sie in Zelle C.5 die Linienparameter für den Kontrast zur Massenkalibrierung ein, dh die Steigung und den Offset, die anhand von Proben bekannter Masse bestimmt wurden, und führen Sie sie aus, um alle Partikelkontraste in die Molekülmasse umzuwandeln. Bewerten Sie die scheinbare Partikeldichte auf der Membran, indem Sie Zelle C.6 ausführen, die den Mediandichtewert in Bezug auf detektierte Partikel und vorhandene Trajektorien während jedes Frames als zusätzliche Spalten im Datenrahmen zurückgibt.
Um das endgültige Diagramm für die Korrelation von Masse und Diffusionskoeffizient zu generieren, führen Sie Zelle D.1 aus, um eine Dateieingabeaufforderung zu laden, und geben Sie die HDF5-Datei mit den MSPT-Ergebnissen an, wählen Sie dann entweder den Datensatz aus einem einzelnen Video aus, um in Zelle D.2 zu plotten, oder kombinieren Sie die Daten aus mehreren Videos zu einem einzigen Datenrahmen, indem Sie die Zelle D.3 ausführen. Da in diesem Beispiel alle Videos Replikate identischer Stichproben sind, wird der Datensatz gepoolt. Zeichnen Sie schließlich die 2D-Kerneldichte auf, indem Sie die Zelle D.4 ausführen.
Wenn Sie zufrieden sind, geben Sie einen Speicherort an, an dem das Diagramm in einer PDF-Datei in Zelle D.5 gespeichert und ausgeführt werden soll. Hier werden repräsentative Bilder der Oberflächenrauheit eines Glasdeckelobjektträgers während der Bildung einer unterstützten Lipiddoppelschicht mit einer intakten unterstützten Lipiddoppelschicht und von beispielhaften Proteinen, die auf einem SLB rekonstituiert wurden, gezeigt. Alle vier Beispiele werden im nativen Modus angezeigt, auf den während der Messung selbst zugegriffen werden kann, und als verarbeitete ratiometrische Bilder nach medianbasierter Hintergrundentfernung.
Eine Kalibrierung, die den Kontrast in Molekülmasse übersetzt, kann erreicht werden, indem Biomoleküle bekannter Masse über einen Biotin-Streptavidin-Biotin-Komplex an ein SLB gebunden werden. Als beispielhafte Strategie kann man biotinylierte Varianten von Rinderserumalbumin, Protein A, alkalischer Phosphatase und Fibronektin verwenden, die an Streptavidin binden, das selbst an biotinhaltige Lipide in der Membran gebunden ist. Der immer stärker ausgeprägte Kontrast dieser beispielhaften Makromoleküle spiegelt das zunehmende Molekulargewicht der jeweiligen biotinylierten Standards wider.
Durch die Zuordnung jedes Peaks der Kontrasthistogramme zur entsprechenden Masse des Oligomerzustandes des Standardproteins wird eine lineare Beziehung zwischen Kontrast und Masse aufgedeckt und kann anschließend für die Analyse unbekannter Makromolekülsysteme genutzt werden. 2D-Korndichteschätzungen sowohl der Masse als auch des Diffusionskoeffizienten von tetravalentem Streptavidin im Komplex mit biotinylierter Aldolase oder mit einem biotinmodifizierten Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper sind hier dargestellt. Die repräsentativen Bilder zeigen einen Vergleich der ermittelten Oligomermassen für den Komplex von tetravalentem Streptavidin mit Biotin-modifizierter Aldolase oder IgG und erwarteten Molekulargewichten.
Mit MSPT können wir Biomoleküle direkt auf Lipidmembranen verfolgen, bestimmen, welche Masse sie haben, wie sie sich bewegen und wie sie interagieren. Ich bin zuversichtlich, dass diese Technik unser Verständnis biologischer Prozesse auf und mit Membranen verändern wird.
