Kütleye duyarlı parçacık takibi ile, lipit membranları üzerinde yayılan bireysel biyomolekülleri gözlemleyebilir ve dinamiklerini gerçek zamanlı olarak ölçebiliriz, hepsi tamamen etiketsizdir. Etiket gerekmediğinden, biyomoleküllerin dinamik davranışını bozma tehlikesi yoktur. Bu yöntemin bir diğer avantajı, membrana bağlı oligomerik durumları belirlememizi sağlayan kütle duyarlılığıdır.
Çok yönlülüğü nedeniyle, bu yöntemi membranla ilişkili herhangi bir sisteme uygulayabiliriz. Özellikle, ligand kaynaklı reseptör komplekslerinin oluşumunu incelemek için kullanılabilir. PTFE tutucularda eşit sayıda mikroskop slaytı dağıtarak başlayın.
PTFE tutucuları beherlere aktarın. Ultra saf su ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca sonikleştirin. Tutucuları temiz beherlere aktarmak ve ultra saf izopropanol eklemek için cımbız kullanın.
15 dakika boyunca tekrar sonikleştirin, sonra tekrar izopropanolü ultra saf suyla değiştirin ve tutucuları içeren beheri 15 dakika boyunca sonikleştirin. Tutucuları beherlerden çıkarın ve tutucudaki mikroskop kızaklarını sabit bir azot gazı veya basınçlı hava akışı altında üfleyerek kurutun. Büyük mikroskop slaytlarını içeren kurutulmuş tutucuyu plazma temizleyiciye yerleştirin ve açın.
Düz kartonu alüminyum folyo ile sarın. Temizlenen 24 milimetre ile 24 milimetre mikroskop kızaklarını alüminyum folyo üzerine birbirleri arasında yeterli mesafe ile yayın. Ardından, çift taraflı bant şeritlerini slaytların üst ve alt kenarlarına takın.
Her mikroskop slaytını, alüminyum folyodan çıkarılabilecek şekilde bir neşterle tüketin. Her slaytta, slaytın üst ve alt kenarlarına tutturulmuş çift taraflı bant şeritleri bulunmalıdır. Ardından slaytı iki çift taraflı bant şeridiyle hidrofilize kızağa takın.
Bu, daha küçük ve daha büyük mikroskop slaytları arasında bir akış yolu oluşturacaktır. Taze ekstrüde edilmiş küçük unilamellar vezikülleri veya SUV'ları, gerekli reaksiyon tamponunda mililitre başına 0,4 miligramlık bir son konsantrasyona kadar seyreltin. İsteğe bağlı olarak, vezikül rüptürünü teşvik etmek için, vezikül süspansiyonuna iki milimolar kalsiyum klorür ekleyin.
Kütle fotometre aşamasına bir akış odası monte edin. Vezikül süspansiyonunun 25 mikrolitresini akış odasına yıkayın ve odayı iki dakika boyunca inkübe edin, ardından akış odasının her seferinde 200 mikrolitre reaksiyon tamponu ile tekrar tekrar yıkanmasıyla kaynaşmamış vezikülleri çıkarın. Lipid zarı kaynaşmamış veziküllerden arındırıldığında, numune odasına ilgilenilen proteinin 50 mikrolitresini ekleyin.
Ardından, edinme yazılımında görüş alanının boyutu, pozlama süresi, kare hızı ve edinme süresi gibi görüntüleme koşullarını ayarlayın. Netlemeyi otomatik olarak ayarlayın. Gerekirse, görüş alanını homojen bir membrana sahip bir konuma taşımak için yanal kontrolü kullanın.
Bir proje klasörü oluşturun ve filmi kaydetmeye başlayın. Kayıt tamamlandıktan sonra, edinme yazılımı tarafından istenen iletişim kutusunda bir dosya adı belirtin. Film, sonraki analizler için otomatik olarak proje klasörüne MP dosyası olarak kaydedilir.
Kaydedilen videoları analiz etmek için Jupyter not defteri uygulamasını başlatın. Görüntülenen klasör listesinde, MSPT çözümlemesinin yapıldığı konuma gidin. ipy notebook dosyası saklanır ve dosyaya tıklayın.
Jupyter not defterlerinde, kod hücrelerde düzenlenir ve adım adım yürütülebilir. Hücrenin yanındaki küçük Oynat düğmesine tıklayın veya bir hücre seçin ve hücreyi yürütmek için Shift Enter tuşuna basın. Analiz için gerekli tüm paketleri içe aktararak başlayın.
Bir dosya istemi başlatmak için bir sonraki hücreyi çalıştırın. Analiz edilecek bir veya daha fazla MP video dosyası içeren bir klasör seçin ve Klasör Seç'e basın. Seçilen dosyaların listesi hücrenin altına yazdırılır.
Piksel tabanlı arka plan tahmin algoritmasıyla ışığın baskın statik saçılımını kaldırmak için, parametre modu için sürekli medyan seçeneğini belirleyin ve kayan medyan penceresi için uygun bir uzunluk ayarlayın. İsteğe bağlı olarak, arka plan kaldırıldıktan sonra filmleri parçacık algılama ve yörünge bağlantısı için kullanmak üzere True save_processed_movies ayarlayarak kaydedin. CPU'da işlem yapmak için paralel Doğru ve GPU Yanlış ayarladığınızdan emin olun veya GPU'da işlem yapmak için tam tersini yapın.
Parçacıklar ve ilgili konumları film boyunca tanımlanır ve lokalize edilir. Parçacık algılamanın hassasiyetini, görüntü ikilileştirme ile aday noktaları vurgulamak için kullanılan bir eşik parametresiyle ayarlayın. Film görselleştirme adı verilen ayrı bir not defterinde değişen eşik parametrelerinin nokta algılama duyarlılığı üzerindeki etkisini inceleyin.
ipy defter. Filmi kare görüntüleyiciye yükledikten sonra, parçacık algılama eşiğini ayarlamak ve uygun bir ayar bulmak için eşik kaydırıcısını kullanın. Diğer not defterine geri döndüğümüzde, Python paket trackpy'sini kullanarak ardışık çerçevelerdeki parçacıkları yörüngelere bağlamak için üç parametre seçin.
Beklenen maksimum difüzyon hızına göre parçacıkların maksimum yer değiştirmesini bir çerçeveden diğerine ayarlayın. Bir parçacığın kaybolabileceği ve yeniden ortaya çıkabileceği, ancak yine de aynı parçacık olarak kabul edilebileceği maksimum çerçeve sayısını seçin. Çok az noktaya sahip yörüngeler, difüzyon katsayılarının daha sağlam bir şekilde belirlenmesi için minimum_trajectory_length parametresi kullanılarak kaldırılabilir.
Hücredeki tüm parametreleri çalıştırarak düzeltin. Seçilen tüm videoları seçilen parametrelerle analiz etmek için bir sonraki hücreyi çalıştırın. Her işleme adımı için ilerleme çubukları hücrenin altında görünür.
Bu işlem, video uzunluğuna, parametre ayarlarına ve donanıma bağlı olarak biraz zaman alabilir. Bir sonraki adımda yazılım, hem atlama mesafesi dağılımına hem de ortalama kare yer değiştirme analizine dayanarak, önceki bölümde bulunan yörüngeler için difüzyon katsayılarını belirler. Film frame_rate ve pixel_size belirterek başlayın.
Hücreyi yürüterek bunları düzeltin, ardından bir sonraki hücreyi çalıştırın ve trackpy tarafından oluşturulan tüm CSV dosyalarını içeren üst dizini seçin. Bulunan CSV dosyalarının listesi hücrenin altına yazdırılır. Bir sonraki hücrede, sonuçların depolandığı HDF5 kapsayıcısı için bir ad seçin ve yürütün.
Son olarak, difüzyon analizini gerçekleştirmek için C.4 hücresini çalıştırın. C.5 hücresinde, kütle kalibrasyon hattı parametrelerinin kontrastını girin, bu da bilinen kütlenin örnekleri kullanılarak belirlenen eğim ve ofset anlamına gelir ve tüm parçacık kontrastlarını moleküler kütleye dönüştürmek için uygulayın. Membran üzerindeki görünür parçacık yoğunluğunu, algılanan parçacıklar açısından medyan yoğunluk değerini döndüren ve her kare sırasında yörüngeleri veri çerçevesinde ek sütunlar olarak sunan C.6 hücresini yürüterek değerlendirin.
Kütle ve difüzyon katsayısının korelasyonuna ilişkin son grafiği oluşturmak için, bir dosya istemi yüklemek üzere D.1 hücresini yürütün ve MSPT sonuçlarını içeren HDF5 dosyasını belirtin, ardından D.2 hücresinde çizilecek tek bir videodaki veri kümesini seçin veya D.3 hücresini yürüterek birden çok videodaki verileri tek bir veri karesinde birleştirin. Bu örnekte, tüm videolar aynı örneklerin kopyaları olduğundan, veri kümesi havuza alınır. Son olarak, D.4 hücresini çalıştırarak 2B çekirdek yoğunluğunu çizin.
Memnun kalırsanız, grafiği D.5 hücresindeki bir PDF dosyasına kaydetmek ve yürütmek için bir konum belirtin. Desteklenen bir lipit çift katmanının oluşumu sırasında, sağlam bir desteklenen lipit çift katmanlı bir cam kapak slaytının yüzey pürüzlülüğünün ve bir SLB üzerinde yeniden oluşturulan örnek proteinlerin temsili görüntüleri burada gösterilmiştir. Dört örneğin tümü, ölçümün kendisi sırasında erişilebilen yerel modda ve medyan tabanlı arka plan kaldırma işleminden sonra işlenmiş oranmetrik görüntüler olarak görüntülenir.
Kontrastı moleküler kütleye çeviren bir kalibrasyon, bilinen kütlenin biyomoleküllerinin bir biyotin-streptavidin-biyotin kompleksi aracılığıyla bir SLB'ye bağlanmasıyla elde edilebilir. Örnek bir strateji olarak, sığır serum albümini, protein A, alkalen fosfataz ve fibronektinin biyotinile edilmiş varyantları, membrandaki biyotin içeren lipitlere bağlı olan streptavidin'e bağlanır. Bu örnek makromoleküllerin giderek daha belirgin hale gelen kontrastı, ilgili biyotinillenmiş standartların artan moleküler ağırlığını yansıtmaktadır.
Kontrast histogramlarının her bir tepe noktasını standart proteinin oligomer durumunun karşılık gelen kütlesine atayarak, kontrast ve kütle arasında doğrusal bir ilişki ortaya çıkar ve daha sonra bilinmeyen makromolekül sistemlerinin analizi için kullanılabilir. Biyotinile aldolaz veya biyotin modifiye keçi anti-Tavşan IgG antikoru ile kompleks halinde bulunan tetravalan streptavidinin hem kütlesinin hem de difüzyon katsayısının 2D çekirdek yoğunluğu tahminleri burada gösterilmiştir. Temsili görüntüler, dört değerlikli streptavidin kompleksi için belirlenmiş oligomer kütlelerinin biyotin modifiye aldolaz veya IgG ve beklenen moleküler ağırlıklarla karşılaştırıldığını göstermektedir.
MSPT ile biyomolekülleri doğrudan lipit membranları üzerinde izleyebilir, hangi kütleye sahip olduklarını, nasıl hareket ettiklerini ve nasıl etkileşime girdiklerini belirleyebiliriz. Bu tekniğin, membranlar üzerindeki ve membranlarla biyolojik süreçler hakkındaki anlayışımızı dönüştüreceğinden eminim.
