原位 冷冻切片斑马鱼胚胎中的杂交结合免疫组织化学

该协议使用原位杂交和免疫组织化学的组合，它是同时分析一种mRNA和一种蛋白质的简单有效的方法。该方案适用于不同阶段的胚胎，不同厚度的组织切片和不同的器官。首先，将大约 10 个胚胎与 0.5 至 1 毫升新鲜的 4% 多聚甲醛固定在 1.5 毫升微量离心管中，在 4 摄氏度下过夜 12 至 14 小时。

通过在室温下依次用PBST中的25,50和75%甲醇洗涤5分钟，逐渐脱水胚胎。然后，在室温下用100%甲醇洗涤胚胎五分钟。将胚胎在零下20摄氏度的100%甲醇中孵育至少过夜，持续12至14小时。

通过在室温下依次用75%，50和25%甲醇在PBST中洗涤5分钟，逐渐使胚胎再水化。再次，在室温下用PBST洗涤胚胎三次，每次五分钟。在室温下用PBST中每毫升蛋白酶K10微克消化胚胎，并用PBST洗涤胚胎三次五分钟。

然后，在室温下将洗涤的胚胎重新固定在4%多聚甲醛中15分钟。同样，用PBST洗涤胚胎三次，同时在每次洗涤期间孵育五分钟。对于胚胎的预杂交，将它们在65摄氏度的预杂交溶液中孵育五分钟。

然后，用杂交溶液替换预杂交溶液，并预杂交至少四个小时。在加入胚胎之前，在杂交溶液中加热探针在95摄氏度下加热五分钟。尽可能多地去除预杂交溶液，不要让胚胎与空气接触。

向装有胚胎的管中，在杂交溶液中加入预热的探针，并使探针在50至70摄氏度下杂交12至14小时。第二天，用移液管吸出探针溶液并将其储存在零下20摄氏度的管中，以便可以多次重复使用。用100%杂交溶液洗涤胚胎，然后在65摄氏度下用75%，50和25%杂交溶液在两倍浓度的SSCT中连续洗涤15分钟。

然后，在65摄氏度下以SSCT浓度的0.2倍洗涤胚胎两次15分钟。在室温下在MABT中洗涤胚胎两次10分钟。在室温下封闭杂交和洗涤的胚胎至少两个小时，用2%封闭溶液-1。

在新鲜的2%封闭溶液-1中用抗地高辛碱性磷酸酶替换封闭溶液-1，并在4摄氏度下摇动12至14小时。然后，在室温下在MABT中洗涤胚胎四次30分钟。同样，在NTMT中洗涤胚胎两次，并使用移液管从胚胎中取出尽可能多的NTMT。

用BM紫色碱性磷酸酶底物替换，并在室温下在黑暗中染色胚胎。一旦污渍形成，用NTMT短暂冲洗两次来停止反应。原位杂交后，用PBST冲洗胚胎三次20分钟。

将胚胎浸入PBS中的5%蔗糖中过夜，在4摄氏度下过夜12至14小时。然后，将覆盖胚胎的溶液在PBS中更改为15%蔗糖，并在4摄氏度下孵育12至16小时。同样，将覆盖胚胎的溶液更换为PBS中的30%蔗糖，并在4摄氏度下孵育一到两天。

将胚胎转移到新的冷冻体中，并用最佳切割温度介质轻轻填充，同时避免形成气泡。接下来，使用低温恒温器将样品切成 12 至 20 微米厚的切片，并将切片快速转移到载玻片上。让样品达到室温，并将切片储存在零下80摄氏度的密封载玻片盒中，以备后续使用。

用PBS清洗包含切片的载玻片五分钟。然后，将载玻片放入缓冲液中，将溶液加热约20分钟，使其接近沸腾温度。沥干多余的溶液，并用纸巾小心地擦干每个部分周围的区域。

然后，用防水笔在该部分周围画一个圆圈以形成疏水屏障，并在室温下将该部分在封闭溶液-2中封闭两个小时。将每张载玻片移取一抗溶液，并将载玻片在4摄氏度的免疫组织化学湿盒中孵育过夜。用PBS洗涤载玻片三次，每次洗涤期间孵育10分钟，并排出多余的PBS。

然后，将载玻片与适当的二抗在室温下在PBS中孵育一小时。同样，用PBS洗涤载玻片三次，同时在每次洗涤期间孵育10分钟，并排出多余的PBS。随后，将安装介质移液到载玻片上，并用载玻片盖玻片安装。

在转基因foxP2 egfp-caax系中检测到中枢神经系统中5-HT2C受体的表达。在转基因系中观察到5-HT2C与foxP2神经元同时表达，狐狸P2神经元被荧光素绿色荧光蛋白标记。在转基因系中检测到斑马鱼脊髓和运动神经元中的锌指转录因子insm1a的表达。

在转基因系中观察到insm1a与hb9神经元同时表达，hb9神经元由荧光素绿色荧光蛋白标记。斑马鱼必须用新鲜制备的多聚甲醛固定。