Ce protocole utilise une combinaison d’hybridation in situ et d’immunohistochimie, et il constitue un moyen simple et efficace d’analyser simultanément un ARNm et une protéine. Ce protocole est applicable aux embryons à différents stades, aux sections de tissus de différentes épaisseurs et aux différents organes. Pour commencer, fixez environ 10 embryons avec 0,5 à 1 millilitre de paraformaldéhyde frais à 4% dans un tube à microfuge de 1,5 millilitre à quatre degrés Celsius pendant la nuit pendant 12 à 14 heures.
Déshydrater progressivement les embryons en les lavant avec du méthanol à 25, 50 et 75% dans du PBST successivement pendant cinq minutes chacun à température ambiante. Ensuite, lavez les embryons dans du méthanol à 100% pendant cinq minutes à température ambiante. Incuber les embryons dans du méthanol à 100% à moins 20 degrés Celsius pendant au moins une nuit, pendant 12 à 14 heures.
Réhydrater progressivement les embryons en les lavant avec du méthanol à 75, 50 et 25% dans du PBST successivement pendant cinq minutes chacun à température ambiante. Encore une fois, lavez l’embryon trois fois avec du PBST pendant cinq minutes chacun à température ambiante. Digérer les embryons avec 10 microgrammes par millilitre de protéinase K dans PBST à température ambiante et laver les embryons trois fois avec PBST pendant cinq minutes.
Ensuite, refixez les embryons lavés dans du paraformaldéhyde à 4% pendant 15 minutes à température ambiante. Encore une fois, lavez l’embryon trois fois avec du PBST pendant l’incubation pendant cinq minutes à chaque lavage. Pour pré-hybrider les embryons, les incuber dans une solution de pré-hybridation à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Ensuite, remplacez la solution de pré-hybridation par la solution d’hybridation et pré-hybridez pendant au moins quatre heures. Chauffer la sonde dans la solution d’hybridation pendant cinq minutes à 95 degrés Celsius avant de l’ajouter aux embryons. Retirer autant de solution de pré-hybridation que possible sans laisser les embryons entrer en contact avec l’air.
Au tube contenant les embryons, ajouter une sonde préchauffée dans la solution d’hybridation et permettre à la sonde de s’hybrider pendant la nuit pendant 12 à 14 heures à 50 à 70 degrés Celsius. Le lendemain, aspirez la solution de sonde avec une pipette et conservez-la dans un tube à moins 20 degrés Celsius afin qu’elle puisse être réutilisée plusieurs fois. Laver les embryons avec une solution d’hybridation à 100% suivie d’un lavage séquentiel avec une solution d’hybridation à 75, 50 et 25% à deux fois la concentration de SSCT pendant 15 minutes à 65 degrés Celsius.
Ensuite, lavez les embryons deux fois et 0,2 fois la concentration de SSCT pendant 15 minutes à 65 degrés Celsius. Laver les embryons deux fois pendant 10 minutes dans MABT à température ambiante. Bloquer les embryons hybrides et lavés pendant au moins deux heures à température ambiante, avec la solution de blocage à 2%-1.
Remplacer la solution bloquante-1 par de l’antidigoxigénine phosphatase alcaline dans une solution bloquante à 2% 1 fraîche et agiter pendant une nuit pendant 12 à 14 heures à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez les embryons quatre fois dans MABT pendant 30 minutes à température ambiante. Encore une fois, lavez les embryons deux fois dans NTMT et retirez autant de NTMT que possible des embryons à l’aide d’une pipette.
Remplacer par le substrat de phosphatase alcaline violette BM et colorer les embryons à température ambiante dans l’obscurité. Une fois que la tache s’est développée, arrêtez la réaction en rinçant brièvement deux fois avec NTMT. Après hybridation in situ, rincer les embryons avec du PBST trois fois pendant 20 minutes.
Immergez les embryons dans du saccharose à 5% dans du PBS pendant la nuit pendant 12 à 14 heures à quatre degrés Celsius. Ensuite, changez la solution recouvrant les embryons à 15% de saccharose dans PBS et incuber pendant une nuit pendant 12 à 16 heures à quatre degrés Celsius. Encore une fois, changez la solution recouvrant les embryons à 30% de saccharose dans PBS et incuber pendant un à deux jours à quatre degrés Celsius.
Transférer les embryons dans un nouveau cryomoule pour tissu et le remplir doucement avec un milieu de température de coupe optimal tout en évitant la formation de bulles. Ensuite, coupez les échantillons en sections de 12 à 20 micromètres d’épaisseur à l’aide d’un cryostat et transférez rapidement les sections sur des lames de verre. Laisser les échantillons atteindre la température ambiante et entreposer les sections dans une boîte à lames scellée à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure.
Lavez les lames contenant les sections avec du PBS pendant cinq minutes. Ensuite, placez les lames dans le tampon et chauffez la solution pendant environ 20 minutes pour la maintenir près de la température d’ébullition. Égoutter l’excès de solution et sécher soigneusement la zone autour de chaque section avec un morceau de tissu.
Ensuite, tracez un cercle autour de la section avec un stylo hydrofuge pour former une barrière hydrophobe et bloquez la section pendant deux heures dans la solution de blocage 2 à température ambiante. Pipeter la solution d’anticorps primaires par lame et incuber les lames dans une boîte humide immunohistochimique à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Lavez les lames trois fois avec du PBS pendant l’incubation pendant 10 minutes à chaque lavage et égouttez l’excès de PBS.
Ensuite, incuber les lames avec l’anticorps secondaire approprié pendant une heure à température ambiante dans PBS. Encore une fois, lavez les lames trois fois avec du PBS pendant l’incubation pendant 10 minutes à chaque lavage, et égoutter l’excès de PBS. Ensuite, pipeter le support de montage sur la glissière et monter avec un couvercle de glissière.
L’expression du récepteur 5-HT2C dans le système nerveux central a été détectée dans la lignée transgénique foxP2 egfp-caax. L’expression simultanée de 5-HT2C a été observée dans la lignée transgénique avec les neurones foxP2, qui ont été marqués par la protéine fluorescente verte fluorescéine. L’expression de insm1a, un facteur de transcription à doigts de zinc dans la moelle épinière et les motoneurones du poisson zèbre, a été détectée dans la lignée transgénique.
L’expression simultanée d’insm1a a été observée dans la lignée transgénique avec les neurones hb9, qui ont été marqués par la protéine fluorescente verte fluorescéine. Le poisson zèbre doit être fixé avec du paraformaldéhyde fraîchement préparé.
