Este protocolo utiliza una combinación de hibridación in situ e inmunohistoquímica, y sirve como una forma fácil y eficiente de analizar simultáneamente un ARNm y una proteína. Este protocolo es aplicable a embriones en diferentes etapas, secciones de tejido de varios grosores y diferentes órganos. Para comenzar, fije aproximadamente 10 embriones con 0.5 a 1 mililitro de paraformaldehído fresco al 4% en un tubo de microfuga de 1.5 mililitros a cuatro grados centígrados durante la noche durante 12 a 14 horas.
Deshidrate gradualmente los embriones lavando con 25, 50 y 75% de metanol en PBST sucesivamente durante cinco minutos cada uno a temperatura ambiente. Luego, lave los embriones en 100% metanol durante cinco minutos a temperatura ambiente. Incubar los embriones en 100% de metanol a menos 20 grados centígrados durante al menos toda la noche, durante 12 a 14 horas.
Rehidrate gradualmente los embriones lavándolos con 75, 50 y 25% de metanol en PBST sucesivamente durante cinco minutos cada uno a temperatura ambiente. Una vez más, lave el embrión tres veces con PBST durante cinco minutos cada uno a temperatura ambiente. Digiera los embriones con 10 microgramos por mililitro de proteinasa K en PBST a temperatura ambiente, y lave los embriones tres veces con PBST durante cinco minutos.
Luego, vuelva a fijar los embriones lavados en paraformaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente. Una vez más, lave el embrión tres veces con PBST mientras incuba durante cinco minutos durante cada lavado. Para la hibridación previa de los embriones, incubarlos en una solución de prehibridación a 65 grados centígrados durante cinco minutos.
Luego, reemplace la solución de prehibridación con la solución de hibridación y prehibridar durante al menos cuatro horas. Caliente la sonda en la solución de hibridación durante cinco minutos a 95 grados centígrados antes de agregarla a los embriones. Retire la mayor cantidad posible de solución de prehibridación sin dejar que los embriones entren en contacto con el aire.
Al tubo que contiene los embriones, agregue una sonda precalentada en la solución de hibridación y permita que la sonda hibrida durante la noche durante 12 a 14 horas a 50 a 70 grados centígrados. Al día siguiente, aspire la solución de la sonda con una pipeta y guárdela en un tubo a menos 20 grados centígrados para que pueda reutilizarse muchas veces. Lave los embriones con solución de hibridación al 100% seguida de lavado secuencial con solución de hibridación al 75, 50% y 25% en el doble de la concentración de SSCT durante 15 minutos a 65 grados centígrados.
Luego, lave los embriones dos veces y 0.2 veces la concentración de SSCT durante 15 minutos a 65 grados centígrados. Lave los embriones dos veces durante 10 minutos en MABT a temperatura ambiente. Bloquear los embriones hibridados y lavados durante al menos dos horas a temperatura ambiente, con solución bloqueante al 2%-1.
Reemplace la solución de bloqueo-1 con fosfatasa alcalina antidigoxigenina en una solución fresca de bloqueo al 2%-1 y agite durante la noche durante 12 a 14 horas a cuatro grados centígrados. Luego, lave los embriones cuatro veces en MABT durante 30 minutos a temperatura ambiente. Una vez más, lave los embriones dos veces en NTMT y retire la mayor cantidad posible de NTMT de los embriones con una pipeta.
Reemplace con sustrato de fosfatasa alcalina púrpura BM y tiñe los embriones a temperatura ambiente en la oscuridad. Una vez que se haya desarrollado la mancha, detenga la reacción enjuagando brevemente dos veces con NTMT. Después de la hibridación in situ, enjuague los embriones con PBST tres veces durante 20 minutos.
Sumerja los embriones en sacarosa al 5% en PBS durante la noche durante 12 a 14 horas a cuatro grados centígrados. Luego, cambie la solución que cubre los embriones a 15% de sacarosa en PBS e incube durante la noche durante 12 a 16 horas a cuatro grados centígrados. Nuevamente, cambie la solución que cubre los embriones a 30% de sacarosa en PBS e incube durante uno o dos días a cuatro grados centígrados.
Transfiera los embriones a un nuevo criomold para tejido y llénelo suavemente con un medio de temperatura de corte óptimo evitando la formación de burbujas. A continuación, corte las muestras en secciones de 12 a 20 micrómetros de espesor con un criostato y transfiera rápidamente las secciones a portaobjetos de vidrio. Permita que las muestras alcancen la temperatura ambiente y guarde las secciones en una caja portaobjetos sellada a menos 80 grados centígrados para su uso posterior.
Lave las diapositivas que contienen las secciones con PBS durante cinco minutos. Luego, coloque los portaobjetos en el tampón y caliente la solución durante aproximadamente 20 minutos para mantenerla cerca de la temperatura de ebullición. Drene el exceso de solución y seque cuidadosamente el área alrededor de cada sección con un trozo de tejido.
Luego, dibuje un círculo alrededor de la sección con una pluma repelente al agua para formar una barrera hidrófoba y bloquee la sección durante dos horas bloqueando la solución-2 a temperatura ambiente. Pipetear la solución de anticuerpos primarios por portaobjetos e incubar los portaobjetos en una caja húmeda inmunohistoquímica a cuatro grados centígrados durante la noche. Lave los portaobjetos tres veces con PBS mientras incuba durante 10 minutos durante cada lavado, y drene el exceso de PBS.
Luego, incubar los portaobjetos con el anticuerpo secundario apropiado durante una hora a temperatura ambiente en PBS. Nuevamente, lave las diapositivas tres veces con PBS mientras incuba durante 10 minutos durante cada lavado y drene el exceso de PBS. Posteriormente, pipete el medio de montaje en la corredera y móntelo con un cubreobjetos deslizante.
La expresión del receptor 5-HT2C en el sistema nervioso central se detectó en la línea transgénica foxP2 egfp-caax. La expresión simultánea de 5-HT2C se observó en la línea transgénica junto con las neuronas foxP2, que fueron marcadas por la proteína fluorescente verde fluoresceína. La expresión de insm1a, un factor de transcripción de dedos de zinc en la médula espinal y las neuronas motoras del pez cebra, se detectó en la línea transgénica.
La expresión simultánea de insm1a se observó en la línea transgénica junto con las neuronas hb9, que fueron marcadas por la proteína fluorescente verde fluoresceína. El pez cebra debe fijarse con paraformaldehído recién preparado.
