Bu protokol, in situ hibridizasyon ve immünohistokimyanın bir kombinasyonunu kullanır ve bir mRNA ve bir proteini aynı anda analiz etmenin kolay ve etkili bir yolu olarak hizmet eder. Bu protokol farklı aşamalardaki embriyolara, çeşitli kalınlıktaki doku kesitlerine ve farklı organlara uygulanabilir. Başlamak için, yaklaşık 10 embriyoyu, 12 ila 14 saat boyunca gece boyunca dört santigrat derecede 1.5 mililitrelik bir mikrofüj tüpünde 0.5 ila 1 mililitre taze% 4 paraformaldehit ile sabitleyin.
PBST'de% 25, 50 ve% 75 metanol ile art arda oda sıcaklığında her biri beş dakika boyunca yıkayarak embriyoları kademeli olarak dehidrate edin. Daha sonra, embriyoları oda sıcaklığında beş dakika boyunca% 100 metanol içinde yıkayın. Embriyoları, en az bir gecede, 12 ila 14 saat boyunca, eksi 20 santigrat derecede% 100 metanol içinde inkübe edin.
PBST'de% 75, 50 ve% 25 metanol ile art arda oda sıcaklığında her biri beş dakika boyunca yıkayarak embriyoları kademeli olarak yeniden sulandırın. Yine, embriyoyu PBST ile üç kez oda sıcaklığında her biri beş dakika boyunca yıkayın. Embriyoları oda sıcaklığında PBST'de mililitre proteinaz K başına 10 mikrogram ile sindirin ve embriyoları beş dakika boyunca PBST ile üç kez yıkayın.
Daha sonra, yıkanmış embriyoları oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit içinde tekrar sabitleyin. Yine, her yıkama sırasında beş dakika boyunca inkübe ederken embriyoyu PBST ile üç kez yıkayın. Embriyoları önceden hibridize etmek için, onları beş dakika boyunca 65 santigrat derecede hibridizasyon öncesi çözeltide inkübe edin.
Ardından, hibridizasyon öncesi çözeltiyi hibridizasyon çözeltisi ile değiştirin ve en az dört saat boyunca önceden hibridize edin. Probu, embriyolara eklemeden önce hibridizasyon çözeltisinde 95 santigrat derecede beş dakika ısıtın. Embriyoların hava ile temas etmesine izin vermeden mümkün olduğunca fazla hibridizasyon öncesi çözeltiyi çıkarın.
Embriyoları içeren tüpe, hibridizasyon çözeltisine önceden ısıtılmış prob ekleyin ve probun gece boyunca 50 ila 70 santigrat derecede 12 ila 14 saat boyunca melezleşmesine izin verin. Ertesi gün, prob çözeltisini bir pipetle aspire edin ve eksi 20 santigrat derecede bir tüpte saklayın, böylece birçok kez tekrar kullanılabilir. Embriyoları% 100 hibridizasyon çözeltisi ile yıkayın, ardından 65 santigrat derecede 15 dakika boyunca SSCT konsantrasyonunun iki katı içinde% 75, 50 ve% 25 hibridizasyon çözeltisi ile sıralı yıkama yapın.
Daha sonra, embriyoları 65 santigrat derecede 15 dakika boyunca SSCT konsantrasyonunun iki kez ve 0.2 katı kadar yıkayın. Embriyoları oda sıcaklığında MABT'de 10 dakika boyunca iki kez yıkayın. Hibridize edilmiş ve yıkanmış embriyoları oda sıcaklığında en az iki saat boyunca,% 2 bloke edici çözelti-1 ile bloke edin.
Bloke edici çözelti-1'i% 2'lik yeni bir bloke edici çözelti-1'de antidigoxigenin alkalen fosfataz ile değiştirin ve dört santigrat derecede 12 ila 14 saat boyunca gece boyunca çalkalayın. Daha sonra, embriyoları MABT'de oda sıcaklığında 30 dakika boyunca dört kez yıkayın. Yine, embriyoları NTMT'de iki kez yıkayın ve bir pipet kullanarak embriyolardan mümkün olduğunca fazla NTMT'yi çıkarın.
BM mor alkalen fosfataz substratı ile değiştirin ve embriyoları karanlıkta oda sıcaklığında boyayın. Leke geliştikten sonra, NTMT ile iki kez kısaca durulayarak reaksiyonu durdurun. In situ hibridizasyondan sonra, embriyoları PBST ile 20 dakika boyunca üç kez durulayın.
Embriyoları, dört santigrat derecede 12 ila 14 saat boyunca gece boyunca PBS'de% 5 sakkaroza batırın. Daha sonra, embriyoları kaplayan çözeltiyi PBS'de% 15 sakkaroz olarak değiştirin ve dört santigrat derecede 12 ila 16 saat boyunca gece boyunca inkübe edin. Yine, embriyoları kapsayan çözeltiyi PBS'de% 30 sakkaroz olarak değiştirin ve dört santigrat derecede bir ila iki gün boyunca inkübe edin.
Embriyoları doku için yeni bir kriyomusta aktarın ve kabarcık oluşumunu önlerken yavaşça optimum kesme sıcaklığı ortamıyla doldurun. Daha sonra, numuneleri bir kriyostat kullanarak 12 ila 20 mikrometre kalınlığında bölümlere ayırın ve bölümleri hızlı bir şekilde cam slaytlara aktarın. Numunelerin oda sıcaklığına ulaşmasına izin verin ve bölümleri daha sonra kullanmak üzere eksi 80 santigrat derecede kapalı bir slayt kutusunda saklayın.
Bölümleri içeren slaytları PBS ile beş dakika boyunca yıkayın. Ardından, slaytları tampona yerleştirin ve kaynama sıcaklığına yakın tutmak için çözeltiyi yaklaşık 20 dakika ısıtın. Fazla çözeltiyi boşaltın ve her bölümün etrafındaki alanı bir parça doku ile dikkatlice kurutun.
Daha sonra, hidrofobik bir bariyer oluşturmak için su itici bir kalemle bölümün etrafına bir daire çizin ve bölümü oda sıcaklığında çözelti-2'yi bloke ederek iki saat boyunca bloke edin. Slayt başına pipet birincil antikor çözeltisi ve slaytları gece boyunca dört santigrat derecede immünohistokimyasal ıslak bir kutuda inkübe edin. Her yıkama sırasında 10 dakika boyunca inkübe ederken slaytları PBS ile üç kez yıkayın ve fazla PBS'yi boşaltın.
Daha sonra, slaytları PBS'de oda sıcaklığında bir saat boyunca uygun ikincil antikorla inkübe edin. Yine, her yıkama sırasında 10 dakika boyunca inkübe ederken slaytları PBS ile üç kez yıkayın ve fazla PBS'yi boşaltın. Daha sonra, montaj ortamını sürgü üzerine pipetleyin ve bir sürgü kapak kayması ile monte edin.
Merkezi sinir sisteminde 5-HT2C reseptörünün ekspresyonu transgenik foxP2 egfp-caax hattında tespit edildi. 5-HT2C'nin eşzamanlı ekspresyonu, transgenik çizgide, floresein yeşil floresan proteini ile etiketlenmiş foxP2 nöronları ile birlikte gözlendi. Zebra balığı omuriliğinde ve motor nöronlarında bir çinko-parmak transkripsiyon faktörü olan insm1a'nın ekspresyonu, transgenik çizgide tespit edildi.
Insm1a'nın eşzamanlı ekspresyonu, transgenik çizgide, floresein yeşil floresan proteini ile etiketlenmiş hb9 nöronları ile birlikte gözlendi. Zebra balığı taze hazırlanmış paraformaldehit ile sabitlenmelidir.
