Questo protocollo utilizza una combinazione di ibridazione in situ e immunoistochimica e serve come un modo semplice ed efficiente per analizzare simultaneamente un mRNA e una proteina. Questo protocollo è applicabile a embrioni in diverse fasi, sezioni di tessuto di vario spessore e diversi organi. Per iniziare, fissare circa 10 embrioni con 0,5-1 millilitro di paraformaldeide fresca al 4% in un tubo di microfuge da 1,5 millilitri a quattro gradi Celsius durante la notte per 12-14 ore.
Disidratare gradualmente gli embrioni lavando con 25, 50 e 75% metanolo in PBST successivamente per cinque minuti ciascuno a temperatura ambiente. Quindi, lavare gli embrioni in metanolo al 100% per cinque minuti a temperatura ambiente. Incubare gli embrioni al 100% metanolo a meno 20 gradi Celsius per almeno una notte, per 12-14 ore.
Reidratare gradualmente gli embrioni lavando con il 75, 50 e 25% di metanolo in PBST successivamente per cinque minuti ciascuno a temperatura ambiente. Ancora una volta, lavare l'embrione tre volte con PBST per cinque minuti ciascuno a temperatura ambiente. Digerire gli embrioni con 10 microgrammi per millilitro di proteinasi K in PBST a temperatura ambiente e lavare gli embrioni tre volte con PBST per cinque minuti.
Quindi, rifissare gli embrioni lavati in paraformaldeide al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente. Ancora una volta, lavare l'embrione tre volte con PBST durante l'incubazione per cinque minuti durante ogni lavaggio. Per pre-ibridare gli embrioni, incubarli in soluzione di pre-ibridazione a 65 gradi Celsius per cinque minuti.
Quindi, sostituire la soluzione di pre-ibridazione con la soluzione di ibridazione e pre-ibridare per almeno quattro ore. Riscaldare la sonda nella soluzione di ibridazione per cinque minuti a 95 gradi Celsius prima di aggiungere agli embrioni. Rimuovere quanta più soluzione di pre-ibridazione possibile senza lasciare che gli embrioni entrino in contatto con l'aria.
Al tubo contenente gli embrioni, aggiungere la sonda preriscaldata nella soluzione di ibridazione e consentire alla sonda di ibridarsi durante la notte per 12-14 ore a 50-70 gradi Celsius. Il giorno successivo, aspirare la soluzione della sonda con una pipetta e conservarla in un tubo a meno 20 gradi Celsius in modo che possa essere riutilizzata molte volte. Lavare gli embrioni con una soluzione di ibridazione al 100% seguita da un lavaggio sequenziale con una soluzione di ibridazione al 75, 50 e 25% in due volte la concentrazione di SSCT per 15 minuti a 65 gradi Celsius.
Quindi, lavare gli embrioni due volte e 0,2 volte la concentrazione di SSCT per 15 minuti a 65 gradi Celsius. Lavare gli embrioni due volte per 10 minuti in MABT a temperatura ambiente. Bloccare gli embrioni ibridati e lavati per almeno due ore a temperatura ambiente, con soluzione bloccante al 2%-1.
Sostituire la soluzione bloccante-1 con fosfatasi alcalina antidigoxigenina in una nuova soluzione bloccante al 2%-1 e agitare per una notte per 12-14 ore a quattro gradi Celsius. Quindi, lavare gli embrioni quattro volte in MABT per 30 minuti a temperatura ambiente. Ancora una volta, lavare gli embrioni due volte in NTMT e rimuovere quanto più NTMT possibile dagli embrioni usando una pipetta.
Sostituire con substrato di fosfatasi alcalina viola BM e colorare gli embrioni a temperatura ambiente al buio. Una volta che la macchia si è sviluppata, interrompere la reazione risciacquando brevemente due volte con NTMT. Dopo l'ibridazione in situ, sciacquare gli embrioni con PBST tre volte per 20 minuti.
Immergere gli embrioni nel 5% di saccarosio in PBS durante la notte per 12-14 ore a quattro gradi Celsius. Quindi, cambiare la soluzione che copre gli embrioni al 15% di saccarosio in PBS e incubare durante la notte per 12-16 ore a quattro gradi Celsius. Ancora una volta, cambiare la soluzione che copre gli embrioni al 30% di saccarosio in PBS e incubare per uno o due giorni a quattro gradi Celsius.
Trasferire gli embrioni in un nuovo criomold per il tessuto e riempirlo delicatamente con un mezzo di temperatura di taglio ottimale evitando la formazione di bolle. Quindi, tagliare i campioni in sezioni spesse da 12 a 20 micrometri usando un criostato e trasferire rapidamente le sezioni su vetrini. Lasciare che i campioni raggiungano la temperatura ambiente e conservare le sezioni in una scatola di scorrimento sigillata a meno 80 gradi Celsius per un uso successivo.
Lavare i vetrini contenenti le sezioni con PBS per cinque minuti. Quindi, posizionare i vetrini nel tampone e riscaldare la soluzione per circa 20 minuti per mantenerla vicino alla temperatura di ebollizione. Scolare la soluzione in eccesso e asciugare accuratamente l'area intorno a ciascuna sezione con un pezzo di tessuto.
Quindi, disegnare un cerchio attorno alla sezione con una penna idrorepellente per formare una barriera idrofobica e bloccare la sezione per due ore bloccando la soluzione-2 a temperatura ambiente. Pipetta la soluzione di anticorpi primari per vetrino e incubare i vetrini in una scatola umida immunoistochimica a quattro gradi Celsius durante la notte. Lavare i vetrini tre volte con PBS durante l'incubazione per 10 minuti durante ogni lavaggio e scolare il PBS in eccesso.
Quindi, incubare i vetrini con l'anticorpo secondario appropriato per un'ora a temperatura ambiente in PBS. Ancora una volta, lavare i vetrini tre volte con PBS durante l'incubazione per 10 minuti durante ogni lavaggio e drenare il PBS in eccesso. Successivamente, pipettare il mezzo di montaggio sulla slitta e montare con una sottoveste di copertura della diapositiva.
L'espressione del recettore 5-HT2C nel sistema nervoso centrale è stata rilevata nella linea transgenica foxP2 egfp-caax. L'espressione simultanea di 5-HT2C è stata osservata nella linea transgenica insieme ai neuroni foxP2, che sono stati marcati dalla proteina fluorescente verde fluoresceina. L'espressione di insm1a, un fattore di trascrizione a dita di zinco nel midollo spinale e nei motoneuroni del pesce zebra, è stata rilevata nella linea transgenica.
L'espressione simultanea di insm1a è stata osservata nella linea transgenica insieme ai neuroni hb9, che sono stati marcati dalla proteina fluorescente verde fluoresceina. Il pesce zebra deve essere fissato con paraformaldeide appena preparata.
