Этот протокол использует комбинацию гибридизации in situ и иммуногистохимии и служит простым и эффективным способом одновременного анализа одной мРНК и одного белка. Этот протокол применим к эмбрионам на разных стадиях, срезам тканей разной толщины и разным органам. Для начала зафиксируйте примерно 10 эмбрионов с 0,5-1 миллилитром свежего 4%-ного параформальдегида в 1,5-миллилитровой пробирке с микрофугой при четырех градусах Цельсия на ночь в течение 12-14 часов.
Постепенно обезвоживайте эмбрионы, промывая 25, 50 и 75% метанолом в PBST последовательно в течение пяти минут каждый при комнатной температуре. Затем промойте эмбрионы в 100% метаноле в течение пяти минут при комнатной температуре. Инкубируйте эмбрионы в 100% метаноле при температуре минус 20 градусов по Цельсию, по крайней мере, в течение ночи, в течение 12-14 часов.
Постепенно регидратируйте эмбрионы, промывая 75, 50 и 25% метанолом в PBST последовательно в течение пяти минут каждый при комнатной температуре. Опять же, трижды промойте эмбрион PBST в течение пяти минут каждый при комнатной температуре. Переварите эмбрионы с 10 микрограммами на миллилитр протеиназы K в PBST при комнатной температуре и трижды промойте эмбрионы PBST в течение пяти минут.
Затем зафиксируйте промытые эмбрионы в 4% параформальдегиде в течение 15 минут при комнатной температуре. Опять же, трижды промойте эмбрион PBST во время инкубации в течение пяти минут во время каждого мытья. Для предварительной гибридизации эмбрионов инкубируйте их в предгибридизационном растворе при температуре 65 градусов Цельсия в течение пяти минут.
Затем замените раствор для предварительной гибридизации раствором для гибридизации и предварительно гибридизуйте в течение не менее четырех часов. Нагрейте зонд в растворе для гибридизации в течение пяти минут при температуре 95 градусов Цельсия перед добавлением к эмбрионам. Удалите как можно больше раствора для предварительной гибридизации, не допуская контакта эмбрионов с воздухом.
В пробирку, содержащую эмбрионы, добавьте предварительно нагретый зонд в гибридизационном растворе и дайте зонду гибридизоваться в течение ночи в течение 12-14 часов при температуре от 50 до 70 градусов Цельсия. На следующий день аспирируйте раствор зонда пипеткой и храните его в пробирке при температуре минус 20 градусов Цельсия, чтобы его можно было использовать многократно. Промойте эмбрионы 100%-ным раствором для гибридизации с последующей последовательной промывкой 75, 50 и 25%-ным раствором для гибридизации в удвоенной концентрации SSCT в течение 15 минут при 65 градусах Цельсия.
Затем промойте эмбрионы в двойную и 0,2-кратную концентрацию SSCT в течение 15 минут при 65 градусах Цельсия. Промойте эмбрионы дважды в течение 10 минут в МАБТ при комнатной температуре. Блокируют гибридизованные и промытые эмбрионы не менее двух часов при комнатной температуре 2%-ным раствором-блокатором-1.
Замените блокирующий раствор-1 антидигоксигениновой щелочной фосфатазой в свежем 2%-ном растворе-блокаторе-1 и встряхните в течение ночи в течение 12-14 часов при четырех градусах Цельсия. Затем промойте эмбрионы четыре раза в МАБТ в течение 30 минут при комнатной температуре. Опять же, дважды промойте эмбрионы в NTMT и удалите как можно больше NTMT из эмбрионов с помощью пипетки.
Замените БМ фиолетовым щелочным фосфатазным субстратом и окрасьте эмбрионы при комнатной температуре в темноте. Как только пятно появится, остановите реакцию, дважды кратковременно промыв NTMT. После гибридизации in situ трижды промойте эмбрионы PBST в течение 20 минут.
Погрузите эмбрионы в 5%-ную сахарозу в PBS на ночь на 12-14 часов при четырех градусах Цельсия. Затем замените раствор, покрывающий эмбрионы, на 15% сахарозы в PBS и инкубируйте в течение ночи в течение 12-16 часов при четырех градусах Цельсия. Опять же, измените раствор, покрывающий эмбрионы, на 30% сахарозы в PBS и инкубируйте в течение одного-двух дней при четырех градусах Цельсия.
Перенесите эмбрионы в новый криомолд для ткани и аккуратно заполните его средой с оптимальной температурой резки, избегая образования пузырьков. Затем разрежьте образцы на срезы толщиной от 12 до 20 микрометров с помощью криостата и быстро перенесите срезы на предметные стекла. Дайте образцам достичь комнатной температуры и храните срезы в герметичной скользящей коробке при температуре минус 80 градусов Цельсия для последующего использования.
Промойте предметные стекла, содержащие разделы, PBS в течение пяти минут. Затем поместите предметные стекла в буфер и нагревайте раствор в течение примерно 20 минут, чтобы поддерживать температуру кипения. Слейте излишки раствора и тщательно просушите область вокруг каждого участка кусочком ткани.
Затем нарисуйте круг вокруг среза водоотталкивающей ручкой, чтобы образовался гидрофобный барьер, и заблокируйте срез на два часа в блокирующем растворе-2 при комнатной температуре. Пипеткой нанесите первичный раствор антител на предметное стекло и инкубируйте предметные стекла в иммуногистохимической влажной коробке при четырех градусах Цельсия в течение ночи. Промойте предметные стекла три раза с помощью PBS во время инкубации в течение 10 минут во время каждой стирки и слейте излишки PBS.
Затем инкубируйте предметные стекла с соответствующим вторичным антителом в течение одного часа при комнатной температуре в PBS. Опять же, трижды промойте предметные стекла PBS во время инкубации в течение 10 минут во время каждой стирки и слейте излишки PBS. Затем нанесите посадочную среду пипеткой на предметное стекло и установите с помощью защитного стекла.
Экспрессия рецептора 5-HT2C в центральной нервной системе была обнаружена в трансгенной линии foxP2 egfp-caax. Одновременная экспрессия 5-HT2C наблюдалась в трансгенной линии вместе с нейронами foxP2, которые были помечены флуоресцеиновым зеленым флуоресцентным белком. Экспрессия insm1a, фактора транскрипции цинкового пальца в спинном мозге и двигательных нейронах рыбок данио, была обнаружена в трансгенной линии.
Одновременная экспрессия insm1a наблюдалась в трансгенной линии вместе с нейронами hb9, которые были помечены флуоресцеиновым зеленым флуоресцентным белком. Рыбки данио-рерио должны быть закреплены свежеприготовленным параформальдегидом.
