该协议旨在验证候选抗HBV化合物是否抑制病毒进入，特别是通过阻断NTCP结合。该技术旨在研究HBV进入或感染的初始步骤是否会被任何候选化合物中断。演示该程序的是Piyanoot Thongsri，我实验室的PSP学生。
要开始测量牛磺胆酸钠共转运多肽或NTCP，请将成熟的肝细胞与八个研磨或更多的乙二胺四乙酸或EDTA孵育15分钟。收集细胞沉淀并通过在PBS中加入300微升3.7%多聚甲醛15分钟来固定肝细胞。然后将细胞悬液转移到1.5毫升微量离心管中，在300G和25摄氏度下离心10分钟。
如前所述，使用含有1%胎牛血清或FBS的700微升PBS在离心机中洗涤细胞两次10分钟。然后在室温下用300微升0.05%Triton X 100在PBS中透化细胞20分钟。离心后，使用含有1%FBS的700微升PBS进行三次洗涤，每次一分钟。
将细胞在 4 摄氏度下与抗 NTCP 的一抗以 1：100 的比例孵育 30 分钟，然后用烫发洗涤缓冲液洗涤三次，然后离心。用与Alexa Fluor 488偶联的二抗在4摄氏度下染色细胞30分钟，并重复三次烫发洗涤缓冲液，每次洗涤1分钟。以300G离心后，用含有1%FBS的200微升PBS重悬细胞沉淀。
在软件中，选择流式细胞术分析的测量参数，包括FSC、SSC、FITC或PE。设置自动补偿调整，并包括手稿中说明的补偿控制。接下来，以每分钟60微升的中等流体流速运行未染色的样品。调整前向散射和侧散射阈值，直到它们覆盖感兴趣的细胞群。
标记该区域中的浇口区域并应用于所有补偿控制。使用未染色的对照设置光电倍增管或PMT荧光，并在负象限中调整FITC或PE的PMT电压。运行阳性染色样品并在阳性象限刻度中调整 FITC 或 PE。
运行未染色、FITC染色或PE对照，计算补偿，并将其应用于样品设置。接下来，运行肝细胞样本以测量NTCP水平。接下来，通过在BD FACSuite窗口，对照管和数据源选项卡上连续选择来开始分析染色的肝细胞。
等待原始数据出现。接下来，在右侧的工作表选项卡中单击椭圆门按钮，使用鼠标光标选择细胞群和 SSC 以及 FSC 点图。然后等待圆圈 P1 出现。
单击间隔门按钮并在异硫氰酸荧光素染色直方图中标记该区域。从最高荧光强度值开始到右侧。屏幕上将显示 P2 行。
单击实验管并观察工作表选项卡中的数据是否发生变化。单击统计信息按钮，然后单击空白区域和工作表。然后，观察牛磺胆酸钠共转运多肽群的统计值。
从100%汇合的MHC孔板中吸出培养基，并加入用威廉E培养基稀释的4微摩尔环孢菌素A两小时。接下来，吸出候选乙型肝炎病毒进入抑制剂，用一毫升含有4%聚乙二醇的威廉姆斯E培养基代替它。然后，将培养基与乙型肝炎病毒颗粒一起在每孔 100 的多重感染下在 37 摄氏度下孵育 18 小时。
然后，将上清液丢弃在两毫升冷PBS中，轻轻旋转以用未结合的乙型肝炎病毒冲洗掉旧培养基。用两毫升完整的威廉E培养基培养细胞7天后，用PBS洗涤细胞，并在室温下用3.7%多聚氰醛和PBS固定15分钟。将感染的细胞与IF封闭溶液在室温下在一抗中以1至200稀释液在4摄氏度下孵育过夜。
然后使用洗涤溶液进行三次洗涤，每次一分钟，然后将细胞与二抗在室温下以一至500稀释液孵育一小时。洗涤三次后，用带有DAPI的防褪色封片介质安装样品，并用玻璃盖玻片盖住。使用配备DAPI和PE滤光片的荧光显微镜，使用20倍物镜检测荧光信号，以确定候选化合物的抗HBV进入活性。
对于细胞结合测定，如前所述制备细胞，并将它们与乙型肝炎病毒颗粒在4摄氏度下孵育两个小时。丢弃培养基后，用两毫升冷PBS轻轻旋转冲洗细胞。然后使用细胞刮刀收获感染的细胞，并用裂解缓冲液破坏细胞。
使用手稿中描述的温度条件将细胞裂解物转移到收集管中，以通过聚合酶链反应提取总DNA。如前所述制备细胞后，将肝细胞与牛磺胆酸钠溶液在室温下孵育15分钟，吸出溶液并用冷HEPES洗涤细胞三次。接下来，加入 300 至 500 微升冷 HEPES，用冰上的细胞刮刀收获细胞。
通过在20千赫兹超声下匀浆细胞20秒，并在冰上孵育五分钟。以10， 000G离心后，收集上清液并使用牛磺胆酸ELISA测定试剂盒评估细胞内牛磺胆酸浓度。要在等温滴定量热仪或ITC仪器中清洗细胞和注射器，请启动ITC软件。
在运行实验突出显示选项卡下，为19个注射点ITCM选择微量校准方法，然后单击打开。当新窗口打开时，单击清洁选项卡，然后在清洁方法窗口中选择用于细胞清洁方法的洗涤按钮和用于注射器清洁方法的冲洗按钮。单击下一步，然后按照屏幕上的说明进行操作。
将样品加载到 ITC 后，单击运行实验选项卡下方的加载按钮。然后单击下一步并按照视频说明进行操作，直到完成此加载步骤。使用注射器，在缓冲液中用15微摩尔NTCP填充样品池中的溶液缓冲液，以参比细胞。
取出多余的溶液，然后用150微摩尔姜黄素配体溶液填充注射器，避免气泡。通过单击“运行试验”选项卡下的“运行”按钮来运行示例。实验信息和设置将显示在左侧。
输入配体蛋白浓度和温度详细信息。单击开始以执行注射过程。等待1.4小时以完成蛋白质配体相互作用。
进样完成后，选择突出显示的分析按钮，使用分析软件分析原始数据。然后，单击概述以显示原始数据并选择拟合模型作为一组绑定位点。观察到肝脏成熟特征，包括双核细胞和多边形形态，特别是在MHC的分化阶段。
在分化HepaRG和分化MHC中观察到NTCP表达大幅增加。在分化MHC中检测到高度糖基化形式的NTCP比在分化HepaRG中检测到更多。分化的MHC细胞中的NTCP水平高于未分化细胞。
病毒免疫荧光染色评估了感染后第七天的抗HBV进入活性，并通过实时聚合酶链反应评估了病毒在细胞表面受体上的结合水平。牛磺胆酸摄取分析表明，候选化合物的惩罚性抑制活性降低了通过NTCP结合的乙型肝炎病毒。通过连续向样品池进样来检测比色变化。
基于一个与数据拟合良好的结合位点绘制标准非线性最小二乘回归。实线表示最适合SBB结合的实验值，并且细胞和乙型肝炎病毒颗粒在4摄氏度下孵育。牛磺胆酸更新可以使用放射性技术进行评估。
放射性牛磺胆酸的水平可以使用液体模拟计数器进行量化。该技术简单而快速地筛选病毒进入任何抗病毒方案的询问活动，这将有助于预防感染或再感染。
