非肝细胞293T-NE-3NRS细胞中乙型肝炎病毒感染的建模

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June 5th, 2020

DOI :

10.3791/61414-v

June 5th, 2020

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Xiaoyue Sun*¹^,²^,³, Xiaoqiang Yang*¹^,²^,³^,⁴, Chui Zeng¹^,²^,³, Fayed Attia Koutb Megahed¹^,²^,³^,⁵, Qi Zhou¹^,²^,³, Tingdang Liu¹^,²^,³, Waqas Iqbal¹^,²^,³, Pingnan Sun¹^,²^,³, Xiaoling Zhou¹^,²^,³

¹Stem Cell Research Center, Shantou University Medical College, ²The Center for Reproductive Medicine, Shantou University Medical College, ³Guangdong Provincial Key Laboratory of Infectious Diseases and Molecular Immunopathology, Shantou University Medical College, ⁴Medical Research Center, Sun Yat-Sen Memorial Hospital, Sun Yat-Sen University, ⁵Department of Nucleic Acid Researches, Genetic Engineering and Biotechnology Research Institute, General Autority - City of Scientific Researches and Technological Applications

副本

肝外HBV病毒复制在肝外综合征的发病机制中起着重要的作用。目前，开始肝病毒感染的细胞培养模型是有限的。我们提出了一个体外非肝感染模型，以帮助确定影响HBV复制的新宿主因素，并研究HBV相关的肾脏疾病。

与传统的乙肝病毒感染模式相比，我们采用并设计了293T细胞系、293T-NE-3NR，并与HpG2.2.15共同培养。HBV 感染应在生物安全二级或生物安全三级实验室进行。应遵循实验室安全做法，以确保实验室人员的安全，所有研究人员应在进行HBV实验前接种疫苗并检测HBS抗体阳性。

首先培养 HepG2.2.15 细胞，请记住，与 HepG2.2.15 接触的所有小贴士、烧瓶、板和管应在处置前一夜之间浸泡在 2%的维苏化中。从液氮中去除含有 HepG2.2.15 细胞的小瓶，在 37 摄氏度的水浴中轻轻旋转解冻。将细胞转移到25厘米方形组织培养瓶中，并加入四毫升完整的培养基。

在37摄氏度和5%的二氧化碳下在加湿的培养箱中培养 HepG2.2.15 细胞。每三天更换一次介质。准备就绪后，将细胞上一提液收集在50毫升离心管中。

牢固地合上盖子，用石蜡薄膜包裹。要去除细胞碎片，请将 HepG2.2.15 上清液与 0.45 微米膜过滤到新的 50 毫升离心管中。然后将14毫升过滤的上清液加入病毒集中器柱并合上盖子。

在水平旋转离心机中以 3，200 次 g 离心，将柱离，35 分钟，然后将 HepG2.2.15 上流液浓缩物收集到 1.5 毫升管中。运行实时 PCR 以确保 HepG2.2.15 中HBV DNA的浓度在标准曲线范围内。在1.5毫升微离心管中，向190微升DMEM中加入10微升，使浓缩物稀释20倍。

与上一液一起，准备负控制、正控和四稀释定量参考。在每个样品中加入450微升HBVDNA提取缓冲液，并在室温下以12，000倍g离心，5分钟。将 PCR 主混合物的 27 微升和放在冰上的 PCR 管中每个样品中的 3 微升 Taq 聚合酶组合在一起。

然后在每个管中加入20微升离心样品。根据手稿方向执行实时 PCR，并导出 CT 值以获取标准曲线。将 HepG2 . 2 . 15 上大分成等分，将其储存在零下 80 摄氏度，直到可以使用。

根据手稿指示准备感染介质。然后在两口井中播种 HepG2-NE，在两口井中播种 293T-NE-3NR 细胞，在一口井中播种 293T-NE。在37摄氏度和5%的二氧化碳下在加湿的培养箱中孵育细胞24小时。

孵育后，观察细胞，如果细胞健康，则继续感染。在每个井中加入500微升的感染复合物，再孵育24小时。用500微升PBS清洗细胞两次。

然后向每井添加一毫升的介质。每两天轻轻更换一次介质。第11天，用500微升PBS轻轻清洗细胞，用冰冰甲醇固定细胞进行免疫荧光。

将 HepG-NE 每井的 10 万个细胞种子分成两口井，293T-NE-3NRs 分成两口井，将 293T-NE 放入一个孔中。种子10万细胞每井的 HepG2.2.15 到五个膜插入在一个单独的六孔板。孵育细胞24小时。

孵育后，确保细胞全部粘附，状态良好。丢弃六孔板中的介质和细胞膜插入物。然后将带 HepG2.2.15 的膜插入物放入六孔板中，用 HepG-NE、293T-NE-3NRs 和 293T-NE 播种。

在37摄氏度和5%的二氧化碳下在加湿培养箱中孵育细胞，每三到四天更换一次培养基。10天后，取出膜插入物，用PBS轻轻清洗细胞两次，用冰冰甲醇固定细胞进行免疫荧光。与HBcAg原抗体和DAPI的孵育，在荧光倒置显微镜上以10倍的靶点观察到时，产生了明显的染色。

用DAPI染色证实了核定位，NTCP-EGFP表达与绿色荧光确认。HBcAg 的表达站点位于红色荧光。当DAPI、NTCP和HBcAg在同一细胞中时，该细胞已成功感染HBV。

Cyclosporin A 组是负对对的，因为它通过阻断 NTCP 阻止 HBV 进入细胞。在293T-NE-3NR中检测到HBcAg，但在293T-NE细胞中未检测到，表明NTCP并不是293T中HBV感染的唯一重要因素。良好的细胞状态和高效的操作是获得成功感染结果的关键。

感染后温和清洗和更换介质也很重要。作为替代方法，基于肝瘤的HBV感染方法与这种方法具有更高的感染效率，适用于抗HBV药物筛查。在293T-NE-3NR中对HBV感染进行建模，由于这些细胞的非肝背景，对传统细胞模型是一种有用的补充。

该方法将有助于研究非肝细胞的HBV感染以及HBV肝脏所需的宿主因子。

摘要

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