由于缺乏有效的细胞培养系统，E型肝炎病毒研究受到阻碍。我们的技术克服了这些限制，为药物设计和疫苗开发铺平道路。通过该协议，我们能够产生传染性高滴度病毒的非包络和包络HV颗粒，促进各种细胞的感染。
执行此协议需要访问 BSA-2 设施，并体验基本的细胞培养技术。要使质粒DNA线性化，将10微克的模板DNA与10微升缓冲液和两微升微升的微球蛋白酶混合，将最终体积与水一起调节至100微升。然后在37摄氏度下孵育溶液一小时，并按照标准协议通过阿加罗斯凝胶电泳确认质粒的线性化。
在质粒DNA分离和线性化后，通过凝胶电泳将非消化质粒DNA与消化质粒DNA进行比较，验证线性化的成功。对于纯化的全长E型肝炎病毒DNA的体外转录，将线性DNA模板的两微克与适当的试剂混合，并使用无核水将溶液的最终体积达到100微升。经过彻底混合后，在37摄氏度下孵育溶液两小时。
两小时后，在管中再加入两升T7RNA聚合酶。然后混合反应，在37摄氏度下孵育管子两个小时。在孵育结束时，用7.5微升DNA消化初始DNA模板，彻底混合并孵育37摄氏度30分钟。
萃取后，根据标准方案，仔细检查由阿加罗斯凝胶电泳的RNA完整性和产量。在低RNA的显著性的情况下，应观察到不同的波段，而不是模糊的污迹。有些步骤需要快速执行，因此需要周密的准备。
此外，特别注意RNA的完整性和细胞的生存能力。为准备人类肝癌细胞进行细胞培养衍生的E型肝炎病毒的产生，将20毫升全DMEM细胞播种到15厘米胶原蛋白涂层培养皿上，并在37摄氏度下孵育，直到达到90%。培养结束时，用10毫升PBS清洗细胞，然后用3毫升0.05%的三毫升在37摄氏度下将其从细胞培养板中分离出来。
将分离的细胞重新放入10毫升完整的DMEM中，将细胞转移到50毫升的圆锥管中进行计数。将5乘10转移到6个细胞中，将新的50毫升管中，每次洗涤用35毫升PBS清洗细胞两次。第二次洗涤后，将细胞放在冰上，而不去除上经剂。
对于目标细胞的电穿孔，补充384微升的细胞混合与2毫摩尔ATP和5毫摩尔谷胱甘肽，随后储存在冰上，直到进一步使用。小心地用整个 400 微升溶液更换上一杯。将五微克纯化病毒基因组RNA加入细胞中，将细胞悬浮液转移到4毫米的奎弗特中，在975微法拉德和270伏特的电穿孔下进行20毫秒的电穿孔。
电穿孔后，使用巴斯德移液器将细胞尽快转移到11毫升完整的DMEM，将10毫升电穿孔细胞的种子转化为涂有胶原蛋白的10厘米培养皿。接下来，在300微升介质中，将1.3倍10添加到第五细胞中，均匀地添加到胶原蛋白涂层的24微蒂板的一口井中，并将盘子和盘子放在细胞培养培养箱中24小时。第二天，用10毫升的新鲜DMEM代替菜中的上一代，将该菜返回细胞培养箱，再用6天。
第5至第7天，根据细胞密度，对转染控制进行免疫荧光染色，以便计算表达目标蛋白质的细胞数量，这些细胞与细胞总数正常化。通过转染控制的免疫荧光染色，可以监测成功的电穿孔。转染效率应超过40%复制缺陷突变体可作为负对照，以确认染色的特异性。
为了收获细胞外培养源性E型肝炎病毒颗粒，在第六天，通过0.45微升网过滤上清液，清除任何细胞碎片，并在4摄氏度下储存收获的细胞外培养物衍生E型肝炎病毒。对于细胞内培养源性乙型肝炎病毒颗粒的收获，用PBS清洗细胞，并在37摄氏度下用1.5毫升0.05%的三辛-EDTA分离细胞。当细胞分离时，停止与8.5毫升DMEM的反应，将细胞悬浮液转移到50毫升管中进行离心。
将1.6毫升的DMEM完整介质加入单个两毫升反应管，并使用800微升的介质重新给细胞，从而将细胞转移到管中。将细胞冷冻在液氮中，随后在冰上解冻细胞三次，然后高速离心产生的 10 分钟，达到 10，000 倍 g。然后将超自然物转移到新管中，而不会干扰细胞碎片颗粒，以储存零下80摄氏度。
为了评估新生产的内、细胞外E病毒库的滴答声，将每100微升 MEM 的滴定剂种子 2 倍至每 100 微升 MEM 的 4 个细胞，放入胶原蛋白涂层的 96 孔微滴板的 60 个中心井中，并在最外层井中每井填充 100 微升 PBS。在37摄氏度的24小时后，在第一排细胞中加入50微升细胞外病毒颗粒上流。彻底混合后，通过将50微升上清液从上一排转移到下一排细胞，直到最后一排细胞，以每井一到三浓度连续稀释井内六次。
要用细胞内细胞培养源性乙型肝炎病毒颗粒感染细胞，在细胞顶部行中加入25微升细胞内病毒颗粒上，并混合在细胞上，然后以一比五的比例连续稀释细胞六次，重复稀释25微升。然后根据手稿中的规程，将板放在细胞培养培养箱中七天，然后进行免疫荧光染色。在孵育和免疫染色后，可以使用免疫荧光显微镜分析板材。
免疫后，可以使用相应的公式计算细胞内和细胞外颗粒的最终滴度。靶细胞感染细胞培养源性E病毒颗粒后，通过连续稀释，奶嘴在1倍10至第5至3倍至10至每毫升6个焦点形成单位之间，可预期从细胞培养物感染非包膜细胞培养源性E病毒颗粒。在感染包膜细胞培养源性乙型肝炎病毒颗粒的培养物中，预计每毫升1倍10至2倍和第四焦点形成单位之间的滴答声。
此外，基因组拷贝与非包膜内感染病毒颗粒的比例通常低于观察到的细胞外细胞培养源性E型肝炎病毒颗粒感染培养物的比例，表明非包膜E病毒物种的特定感染率较高。病毒颗粒产生和靶向细胞感染需要一个完整的病毒生命周期，并且可以提供病毒宿主相互作用的新见解。该协议可以修改以执行复制动力学或生成可用于感染测定的粒子。
我们目前的主要研究依赖于传染性颗粒，无论是包络的，也是非包络的 HEV。目前，使用我们技术的文章正在发布中。
