该协议可用于准确测量单个细胞中存在的线粒体DNA拷贝数和某些类型的线粒体DNA突变的水平。以前的方法可以在含有许多细胞的组织样本中准确地进行这些测量。这种技术的主要优点是我们可以在单个细胞中进行相同的测量。
这种方法对那些研究线粒体的人特别有用，并将在该领域有广泛的应用。有效分离和裂解单细胞是该技术的关键。以前使用单细胞分选的经验将非常有帮助。
首先，如文中所述，在冰上制备不含样品DNA的PCR预混液。短暂涡旋后，将所需体积的制备预混液分配到液滴生成PCR 96孔板的每个孔中，将样品排列在全柱中。接下来，将预混液添加到不完整列中的任何空孔中，以将其用作非模板对照。
然后将输入的DNA添加到每个孔中，使每个孔的总体积为22微升。用粘性板密封板，并将其放在2000 RPM的摇床上一分钟。然后将板以 1000 倍 G 在 4 摄氏度下离心一分钟，然后将其放在冰上。
对于液滴生成，首先确保液滴发生器已通电，并检查一瓶液滴发生油是否装载到仪器甲板的位置 E。然后单击触摸屏上的配置样品板。选择样品板上包含样品或空白的所有色谱柱后，单击“确定”以确认板配置。
接下来，将液滴发生器盒装载到仪器甲板上的位置B，使所有灯都变成绿色，并将一个空的吸头废液槽放入位置C.然后将带盖的过滤器吸头盒装载到仪器台上的位置D，以便所有灯都变成绿色。接下来，在将样品板装载到仪器甲板的位置 F 之前取下粘性密封，使指示灯变为绿色。还将空液滴收集的96孔板装入凉爽的块中，在零下20摄氏度下预冷，在位置G处使灯变绿。
单击仪器触摸屏上的开始液滴生成，液滴发生器盖将自动关闭。液滴生成完成后，目视检查样品收集板，以确认每个孔的油相上方是否存在液滴乳液层。接下来，打开板封口机的电源，将温度设置为180摄氏度，密封时间为五秒。
让机器达到工作温度。然后将样品收集板放在板封口机的板架上，并在板顶部放置一个新的箔密封，红线朝上。当印版封口机达到其工作温度时，在仪器触摸屏上按弹出。
将板架放入板封口机的抽屉后，按封盖关闭抽屉。密封完成后，抽屉将自动打开。取出密封板并将其放在冷块上。
然后关闭板封口机。为了运行PCR，将密封的液滴收集板放入具有96深孔块的PCR机器中。PCR完成后，打开液滴读取器和连接的计算机的电源。
将装有PCR后样品的板装入液滴读数器板支架中。将铝箔盖放在样品板上的同时，将盖子放在支架的顶部，并用黑色锁定夹将其固定到位。接下来，要打开液滴阅读器盖，请按下打开/关闭按钮。
然后将带有样品板的液滴读取板支架装入读取器室，并将其牢固地放在磁性底座上。再次按下打开/关闭按钮以合上盖子。打开分析软件界面。
选择“添加板”选项卡，单击“添加板”，然后单击“配置板”。在板信息选项卡中，输入板名称，从超级混合下拉菜单中选择探针的超级混合、无DUTP，然后在保存数据文件下输入文件名 As.In“选井”选项卡，突出显示要分析的孔，然后单击包括所选孔。然后在“井信息”选项卡中，选择要注释的井。
从实验类型下拉菜单中选择直接定量。然后填充样品描述、样品类型和目标名称框，并根据需要添加孔注释和/或板注释。然后单击应用。
板配置完成后，单击开始运行。对于结果分析，请选择“数据分析”选项卡，然后从“我的数据文件”菜单中打开要分析的文件。然后单击“1D 振幅”选项卡（用于单色实验）或“2D 振幅”选项卡（用于双色实验）。
接下来，选择需要阈值的孔。使用阈值线模式工具在幅度图上正负群体之间的间隙中手动应用阈值，确保十字准线的位置使四个液滴群体清晰分开。对所有样本应用阈值后，通过单击“数据表”选项卡的“导入/导出”，然后选择“将可见数据导出为 CSV”，将结果导出为 csv 文件以供进一步分析。
输入合适的文件名，然后单击保存。该协议中使用的PCR和液滴读取程序表明，在fam和hex通道中都存在明确分离的阳性和阴性液滴群体。两种探针均呈阳性的线粒体DNA群体也可以与单细胞裂解物区分开来。
该方法还表明，对于线粒体DNA缺失的样品，存在双阳性液滴和仅对DNA未缺失部分呈阳性的液滴的混合群体。该方法已成功用于计数多种哺乳动物细胞（包括小鼠卵母细胞和原代小鼠胚胎细胞）中每个细胞的线粒体DNA拷贝数。此外，在具有高缺失异质性的细胞中，发现单探针阳性群体明显大于双阳性群体。
然而，在具有低缺失异质性的细胞中，两个群体的大小相似。因此，准确的结果始终确保液滴生成成功，并且使用 1D 或 2D 振幅视图适当地应用阈值。未使用的裂解物可用于其他单细胞测定，例如焦磷酸测序，它可以测量单核苷酸多态性异质性。
这项技术的发展使我们能够准确测量线粒体DNA拷贝数和单个细胞中的缺失异质性，这在以前是不可能的。
