이 프로토콜은 개별 세포에 존재하는 미토콘드리아 DNA의 사본 수와 특정 유형의 미토콘드리아 DNA 돌연변이 수준을 정확하게 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 이전 방법은 많은 세포를 포함하는 조직 샘플에서 이러한 측정을 정확하게 수행 할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 셀에서 동일한 측정을 수행 할 수 있다는 것입니다.
이 방법은 특히 미토콘드리아를 연구하는 사람들에게 사용되며 이 분야에서 광범위하게 적용될 것입니다. 단일 세포의 효과적인 분리 및 용해가 이 기술의 핵심입니다. 단일 셀 정렬에 대한 이전 경험은 매우 도움이 될 것입니다.
시작하려면 텍스트에 설명된 대로 얼음에 샘플 DNA가 없는 PCR을 위한 마스터 믹스를 준비합니다. 간단히 볼텍싱한 후, 제조된 마스터 믹스의 필요한 부피를 액적 생성 PCR 96-웰 플레이트의 각 웰에 분배하고, 샘플을 전체 컬럼에 배열한다. 다음으로, 마스터 믹스를 불완전한 열의 빈 우물에 추가하여 템플릿이 아닌 컨트롤로 사용합니다.
그런 다음 각 웰에 입력 DNA를 추가하여 각 웰의 총 부피를 22 마이크로 리터로 만듭니다. 접착 플레이트 씰로 플레이트를 밀봉하고 2000RPM의 셰이커에 1분 동안 놓습니다. 그런 다음 접시를 섭씨 4도에서 1분 동안 1000배 G로 원심분리한 후 얼음 위에 놓습니다.
액적 생성의 경우 먼저 액적 발생기의 전원이 켜져 있는지 확인하고 액적 생성 오일 병이 계기 데크의 E 위치에 로드되었는지 확인하십시오. 그런 다음 터치 스크린에서 샘플 플레이트 구성을 클릭합니다. 샘플 또는 블랭크가 포함된 샘플 플레이트의 모든 컬럼을 선택한 후 확인을 클릭하여 플레이트 구성을 확인합니다.
그런 다음 액적 발생기 카트리지를 계기판 데크의 B 위치에 로드하여 모든 표시등이 녹색으로 바뀌고 빈 팁 폐기물통을 C 위치에 놓습니다.그런 다음 뚜껑을 제거한 필터 팁 상자를 계기 스테이지의 D 위치로 로드하여 모든 표시등이 녹색으로 바뀌도록 합니다. 다음으로, 표시등이 녹색으로 바뀌도록 계기판의 F 위치에 샘플 플레이트를 로드하기 전에 접착 씰을 제거합니다. 또한 빈 액적 수집 96웰 플레이트를 냉각 블록에 넣고 섭씨 영하 20도에서 미리 냉각하여 표시등이 녹색으로 바뀌도록 G 위치에 놓습니다.
기기 터치 스크린에서 액적 생성 시작을 클릭하면 액적 발생기 덮개가 자동으로 닫힙니다. 액적 생성이 완료되면 샘플 수집 플레이트를 육안으로 확인하여 각 웰의 오일 상 위에 액적 에멀젼 층이 존재하는지 확인합니다. 그런 다음 플레이트 실러의 전원을 켜고 온도를 섭씨 180도로 설정하고 밀봉 시간을 5초로 설정합니다.
기계가 작동 온도에 도달하도록 합니다. 그런 다음 샘플 수집 플레이트를 플레이트 실러의 플레이트 홀더에 놓고 빨간색 선이 위쪽을 향하도록 플레이트 상단에 새 호일 씰을 놓습니다. 플레이트 실러가 작동 온도에 도달하면 기기 터치 스크린에서 꺼내기를 누릅니다.
플레이트 홀더를 플레이트 실러의 서랍에 넣은 후 씰을 눌러 서랍을 닫습니다. 밀봉이 완료되면 서랍이 자동으로 열립니다. 밀봉 된 판을 제거하고 콜드 블록에 놓습니다.
그런 다음 플레이트 실러를 끕니다. PCR을 실행하려면 밀봉된 액적 수집 플레이트를 96 딥웰 블록이 있는 PCR 기계에 놓습니다. PCR이 완료되면 액적 판독기와 연결된 컴퓨터의 전원을 켭니다.
PCR 후 샘플이 있는 플레이트를 액적 판독기 플레이트 홀더에 로드합니다. 샘플 플레이트에 호일 뚜껑을 유지하면서 덮개를 홀더 상단에 놓고 검은색 잠금 클립으로 제자리에 고정합니다. 그런 다음 액적 판독기 덮개를 열려면 열기/닫기 버튼을 누릅니다.
그런 다음 샘플 플레이트와 함께 액적 판독기 플레이트 홀더를 판독기 챔버에 로드하고 마그네틱 베이스에 단단히 놓습니다. 열기/닫기 버튼을 다시 눌러 덮개를 닫습니다. 분석 소프트웨어 인터페이스를 엽니다.
Add Plate(플레이트 추가) 탭을 선택하고 Add Plate(플레이트 추가)를 클릭한 다음 Plate 구성을 클릭합니다. 플레이트 정보 탭에서 플레이트 이름을 입력하고 Supermix 드롭다운 메뉴에서 프로브용 Supermix, DUTP 없음을 선택하고 웰 선택 탭 As.In 데이터 파일 저장 아래에 파일 이름을 입력하고 분석할 웰을 강조 표시한 다음 선택한 웰 포함을 클릭합니다. 그런 다음 웰 정보 탭에서 주석을 달 웰을 선택합니다.
실험 유형 드롭다운 메뉴에서 직접 정량화를 선택합니다. 그런 다음 샘플 설명, 샘플 유형 및 대상 이름 상자를 채우고 필요에 따라 웰 노트 및/또는 플레이트 노트를 추가합니다. 그런 다음 적용을 클릭합니다.
플레이트 구성이 완료되면 실행 시작을 클릭합니다. 결과 분석을 위해 데이터 분석 탭을 선택하고 내 데이터 파일 메뉴에서 분석할 파일을 엽니다. 그런 다음 단색 실험의 경우 1D 진폭 탭을 클릭하고 2색 실험의 경우 2D 진폭 탭을 클릭합니다.
다음으로 임계 값이 필요한 우물을 선택하십시오. 임계값 선 모드 도구를 사용하여 진폭 플롯에서 양수 집단과 음수 집단 사이의 빈 공간에 임계값을 수동으로 적용하여 4개의 액적 모집단이 명확하게 분리되도록 십자선이 배치되도록 합니다. 모든 샘플에 임계값이 적용되면 데이터 테이블 탭, 가져오기/내보내기를 클릭하고 표시되는 데이터를 CSV로 내보내기를 선택하여 추가 분석을 위해 결과를 csv 파일로 내보냅니다.
적절한 파일 이름을 입력하고 저장을 클릭합니다. 이 프로토콜에 사용된 PCR 및 액적 판독 절차는 fam 및 hex 채널 모두에서 양성 및 음성 비말의 명확하게 분리된 집단의 존재를 입증했습니다. 두 프로브 모두에 대해 양성인 미토콘드리아 DNA 집단은 또한 단일 세포 용해물과 구별될 수 있었다.
이 방법은 또한 미토콘드리아 DNA에서 결실 된 샘플의 경우, 이중 양성 방울과 DNA의 결실되지 않은 부분에만 양성인 물방울의 혼합 집단이 존재한다는 것을 보여주었습니다. 이 방법은 마우스 난모세포 및 일차 마우스 배아 세포를 포함한 다양한 포유류 세포에서 세포당 미토콘드리아 DNA 복제 수를 계수하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 더욱이, 결실이 높은 이종질을 갖는 세포에서, 단일 프로브에 대해 양성인 집단은 이중 양성 집단보다 유의하게 더 큰 것으로 밝혀졌다.
그러나, 낮은 결실 이종 plasmy를 갖는 세포에서, 두 집단은 비슷한 크기였다. 따라서 정확한 결과는 항상 액적 생성이 성공하고 1D 또는 2D 진폭 보기를 사용하여 임계값이 적절하게 적용되었는지 확인합니다. 사용되지 않은 용해물은 단일 뉴클레오티드 다형성 이형질을 측정할 수 있는 파이로시퀀싱과 같은 다른 단일 세포 분석에 사용할 수 있습니다.
이 기술의 개발로 이전에는 불가능했던 개별 세포에서 미토콘드리아 DNA 복제 수와 결실 이형질을 정확하게 측정 할 수있었습니다.
