Ce protocole peut être utilisé pour mesurer avec précision le nombre de copies d’ADN mitochondrial présentes dans les cellules individuelles et le niveau de certains types de mutation de l’ADN mitochondrial. Les méthodes précédentes peuvent effectuer avec précision ces mesures dans des échantillons de tissus contenant de nombreuses cellules. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons effectuer les mêmes mesures dans des cellules individuelles.
Cette méthode est particulièrement utile pour ceux qui étudient les mitochondries et aura de nombreuses applications dans ce domaine. L’isolement et la lyse efficaces des cellules individuelles sont la clé de cette technique. Une expérience antérieure avec le tri unicellulaire serait très utile.
Pour commencer, préparez le mélange principal pour la PCR sans l’échantillon d’ADN sur la glace, comme décrit dans le texte. Après avoir vortex brièvement, distribuer le volume requis du mélange maître préparé dans chaque puits d’une plaque PCR 96 puits de génération de gouttelettes, en organisant les échantillons en colonnes complètes. Ensuite, ajoutez le mélange principal à tout puits vide dans des colonnes incomplètes pour les utiliser comme contrôles sans modèle.
Ajoutez ensuite l’ADN d’entrée à chaque puits pour faire le volume total de chaque puits 22 microlitres. Scellez la plaque avec un joint adhésif et placez-la sur un shaker à 2000 tr / min pendant une minute. Ensuite, centrifugez la plaque à 1000 fois G pendant une minute à quatre degrés Celsius avant de la placer sur de la glace.
Pour la génération de gouttelettes, assurez-vous d’abord que le générateur de gouttelettes est allumé et vérifiez si une bouteille d’huile génératrice de gouttelettes est chargée à la position E du pont d’instruments. Cliquez ensuite sur Configurer la plaque d’échantillonnage sur l’écran tactile. Après avoir sélectionné toutes les colonnes de la plaque d’échantillonnage contenant les échantillons ou les blancs, cliquez sur OK pour confirmer la configuration de la plaque.
Ensuite, chargez les cartouches du générateur de gouttelettes à la position B sur le pont des instruments de sorte que tous les voyants deviennent verts et placez une auge à déchets vide en position C.Ensuite, chargez les boîtes d’embouts filtrantes avec les couvercles retirés à la position D sur la scène d’instruments afin que tous les voyants deviennent verts. Ensuite, retirez le joint adhésif avant de charger la plaque d’échantillon à la position F du pont d’instruments afin que le voyant passe au vert. Chargez également une plaque vide de collecte de gouttelettes à 96 puits placée dans un bloc froid, pré-refroidi à moins 20 degrés Celsius, à la position G afin que le feu passe au vert.
Cliquez sur Start Droplet Generation (Démarrer la génération de gouttelettes) sur l’écran tactile de l’instrument et le couvercle du générateur de gouttelettes se fermera automatiquement. Une fois la génération de gouttelettes terminée, vérifiez visuellement la plaque de prélèvement de l’échantillon pour confirmer qu’une couche d’émulsion de gouttelettes est présente au-dessus de la phase huileuse dans chaque puits. Ensuite, allumez le scellant à plaques et réglez la température à 180 degrés Celsius et le temps de scellement à cinq secondes.
Laissez la machine atteindre la température de fonctionnement. Placez ensuite la plaque de prélèvement d’échantillons sur le porte-plaque du scellant à plaques et placez un nouveau joint en aluminium sur le dessus de la plaque avec la ligne rouge tournée vers le haut. Lorsque le scellant à plaques a atteint sa température de fonctionnement, appuyez sur l’option Éjecter sur l’écran tactile de l’instrument.
Après avoir placé le porte-plaque dans le tiroir du scellant à plaques, appuyez sur le sceau pour fermer le tiroir. Une fois le scellage terminé, le tiroir s’ouvrira automatiquement. Retirez la plaque scellée et placez-la sur le bloc froid.
Éteignez ensuite le scellant à plaques. Pour exécuter la PCR, placez la plaque de collecte de gouttelettes scellée dans une machine de PCR avec un bloc de puits profond 96. Une fois la PCR terminée, mettez sous tension le lecteur de gouttelettes et l’ordinateur connecté.
Chargez la plaque avec les échantillons post-PCR dans le support de plaque du lecteur de gouttelettes. Tout en gardant le couvercle en aluminium sur la plaque d’échantillonnage, placez le couvercle sur le dessus du support et fixez-le en place avec des clips de verrouillage noirs. Ensuite, pour ouvrir le couvercle du lecteur de gouttelettes, appuyez sur le bouton d’ouverture/fermeture.
Ensuite, chargez le porte-plaque de lecteur de gouttelettes avec la plaque d’échantillon dans la chambre de lecture et placez-le solidement sur la base magnétique. Appuyez à nouveau sur le bouton d’ouverture/fermeture pour fermer le couvercle. Ouvrez l’interface du logiciel d’analyse.
Sélectionnez l’onglet Ajouter une plaque, cliquez sur Ajouter une plaque, puis sur Configurer une plaque. Dans l’onglet Informations sur la plaque, entrez un nom de plaque, sélectionnez Supermix for Probes, No DUTP dans le menu déroulant Supermix (Supermix) et entrez un nom de fichier sous Save Data File As.In l’onglet Well Selection (Sélection des puits), mettez en surbrillance les puits à analyser et cliquez sur Include Selected Wells (Inclure les puits sélectionnés). Ensuite, dans l’onglet Informations sur le puits, sélectionnez les puits à annoter.
Sélectionnez Quantification directe dans le menu déroulant Type d’expérience. Remplissez ensuite les zones de description de l’échantillon, de type d’échantillon et de nom de cible, puis ajoutez des notes de puits et/ou des notes de plaque si nécessaire. Cliquez ensuite sur Appliquer.
Une fois la configuration de la plaque terminée, cliquez sur Démarrer l’exécution. Pour l’analyse des résultats, sélectionnez l’onglet Analyse des données et ouvrez le fichier à analyser dans le menu Mes fichiers de données. Cliquez ensuite sur l’onglet Amplitude 1D pour les expériences monocolores ou sur l’onglet Amplitude 2D pour les expériences bicolores.
Ensuite, sélectionnez les puits qui nécessitent un seuillage. Utilisez l’outil Mode ligne de seuil pour appliquer manuellement le seuil dans l’espace libre entre les populations positives et négatives sur le diagramme d’amplitude, en veillant à ce que le réticule soit placé de manière à ce que les quatre populations de gouttelettes soient clairement séparées. Une fois le seuil appliqué à tous les échantillons, exportez les résultats sous forme de fichier csv pour une analyse plus approfondie en cliquant sur l’onglet Tableau de données, Importer/Exporter, puis en sélectionnant Exporter les données visibles au format CSV.
Entrez un nom de fichier approprié et cliquez sur Enregistrer. Les procédures de PCR et de lecture des gouttelettes utilisées dans ce protocole ont démontré la présence de populations clairement séparées de gouttelettes positives et négatives, à la fois dans les canaux fam et hexadécimal. Les populations d’ADN mitochondrial positives pour les deux sondes ont également pu être distinguées des lysats unicellulaires.
Cette méthode a également montré que pour les échantillons avec des délétions dans l’ADN mitochondrial, une population mixte de gouttelettes doublement positives et de gouttelettes positives pour la partie non supprimée de l’ADN est présente. Cette méthode a été utilisée avec succès pour compter le nombre de copies d’ADN mitochondrial par cellule dans une variété de cellules de mammifères, y compris les ovocytes de souris et les cellules embryonnaires primaires de souris. De plus, dans les cellules présentant une hétéroplasie à délétion élevée, la population positive pour une seule sonde s’est avérée significativement plus grande que la population doublement positive.
Cependant, dans les cellules à faible hétéroplasmie, les deux populations étaient de taille similaire. Ainsi, des résultats précis garantissent toujours que la génération de gouttelettes a été réussie et que le seuillage a été appliqué de manière appropriée à l’aide de la vue d’amplitude 1D ou 2D. Le lysat inutilisé peut être utilisé pour d’autres tests unicellulaires, tels que le pyroséquençage, qui peut mesurer l’hétéroplasie du polymorphisme mononucléotidique.
Le développement de cette technique nous a permis de faire des mesures précises du nombre de copies d’ADN mitochondrial et de l’hétéroplasmie de délétion dans des cellules individuelles, ce qui n’était pas possible auparavant.
