使用二分法减少牛卵母细胞中的线粒体DNA

该方案显着降低了卵母细胞中的线粒体DNA拷贝数。这可能有利于种内克隆。该方法将牛卵母细胞中的线粒体DNA拷贝数减少90%以上，从而降低克隆胚胎中线粒体异质体的发生率。

劳拉·亚当斯（Laura Adams）是我实验室的一名博士生，他将演示该程序。首先，使用移液管，从HSOF滴剂中收集选定的成熟卵母细胞，并将它们放入含有50微升HSOF CB溶液的1.5毫升管中。将卵母细胞以15， 000倍G离心12分钟。

在离心卵母细胞时，准备二分切板。为此，首先使用每滴20微升在60毫米培养皿的盖子上制作图案，并用矿物油完全覆盖滴剂。使用细尖的标记，标记盘子下面的线条。

用不透明的盖子盖住培养皿，直到离心完成，以防止微滴的渗透压变化。一旦离心完成，使用200微升移液管收集溶液中的卵母细胞，并将它们移动到带有四个400微升HSOF滴剂的新搜索板的空部分，然后通过HSOF滴剂洗涤卵母细胞。将加热台打开至38.5摄氏度。

使用口移液管将离心的卵母细胞从HSOF液滴移动到二分切片板的左上角T2液滴。然后将卵母细胞清洗通过顶排接下来的三滴。将卵母细胞沉积在其中一个原酶滴剂中，确保它们之间几乎没有接触。

观察卵母细胞，直到透明带有明显的变形。一旦单个卵母细胞透明带变形，将该卵母细胞移动到相邻的T2滴。当其他卵母细胞变形时重复上述步骤，直到所有卵母细胞均已从原酶中取出并置于T2滴剂中。

观察卵母细胞，直到只剩下一层薄薄的透明质层。通过行内接下来的三滴洗涤卵母细胞，然后将其沉积在CBT20滴剂内的垂直线上。从垂直线中较少的卵母细胞开始，并随着二分法技能的进展增加每滴卵母细胞的数量。

将注意力集中在第一个包含卵母细胞的最左侧的CBT20滴剂上，并使用嘴移液管旋转卵母细胞，使每个卵母细胞的线粒体致密部分朝向或远离显微镜的手臂。将微叶片的尖端放在最上面的卵母细胞的左侧，与线粒体致密部分的正上方的空间一致。将刀片的尖端保持在同一位置，小心地放下刀片以一直穿过卵母细胞。

确保线粒体致密的ooplast和线粒体减少的ooplast具有相同的大小，并且叶片在离心的卵母细胞的最清晰的部分中一分为二。抬起刀片时，请确保保持相同的线，并且刀片的尖端保持在同一位置，然后轻轻地将尖端从板上抬起。对第一滴二分滴中的所有卵母细胞重复二分法步骤。

如果卵母细胞存在于额外的滴剂中，则将剩余的卵母细胞定向并一分为二。使用口移液器，从第一个二分滴中收集线粒体减少的ooplasts。将它们放在位于板底部一排的左侧T20液滴中。

对所有剩余的二分滴液重复上述步骤。使用口移液器，从第一个二分滴中收集线粒体密集的ooplasts。将它们放在位于板底排的右侧T20液滴中。

对所有剩余的二分滴液重复上述步骤。从培养箱中取出T10四孔培养皿。使用口移液器，将所有线粒体减少的ooplast移动到标记良好的MR中，并将线粒体致密的ooplast移动到标记良好的M.将四孔板放回二氧化碳控制的培养箱中。

在对mtDNA进行定量之前，让卵子休息至少30分钟。为了成功进行二分切，来自整个卵母细胞和线粒体致密的ooplasts的样品具有相似的CT值。与其他两组样品相比，来自线粒体减少的卵巢的样品具有更高的CT值。

对于不成功的二分切，二分切不能有效降低线粒体还原的ooplast中的mtDNA含量。在产生标准曲线和使用提供的mtDNA拷贝数公式之后，使用该协议已经实现了93.88%的平均卵母细胞mtDNA减少。正确定位两分滴中的每个卵母细胞，精确地将每个卵母细胞一分为二，并准确地分选ooplasts，这些都是为了获得成功结果而需要采取的关键步骤。

两个卵子可以与一个体细胞融合。然后，融合的三胞胎可以被化学激活并培养成重建的胚胎。