Este protocolo pode ser usado para medir com precisão o número de cópias de DNA mitocondrial presentes em células individuais e o nível de certos tipos de mutação do DNA mitocondrial. Métodos anteriores podem fazer com precisão essas medições em amostras de tecido contendo muitas células. A principal vantagem desta técnica é que podemos fazer as mesmas medições em células individuais.
Este método é particularmente útil para aqueles que estudam mitocôndrias e terá amplas aplicações neste campo. O isolamento eficaz e a lise de células individuais são fundamentais para esta técnica. A experiência anterior com a classificação de célula única seria muito útil.
Para começar, prepare a mistura mestra para a PCR sem o DNA da amostra no gelo, conforme descrito no texto. Após o vórtice brevemente, distribua o volume necessário da mistura mestra preparada para cada poço de uma placa de 96 poços de geração de gotículas, organizando as amostras em colunas completas. Em seguida, adicione a mistura mestre a qualquer poço vazio em colunas incompletas para usá-las como controles que não sejam de modelo.
Em seguida, adicione o DNA de entrada a cada poço para fazer o volume total de cada poço 22 microlitros. Sele a placa com uma vedação de placa adesiva e coloque-a em um agitador a 2000 RPM por um minuto. Em seguida, centrifugar a placa a 1000 vezes G por um minuto a quatro graus Celsius antes de colocá-la no gelo.
Para a geração de gotículas, primeiro certifique-se de que o gerador de gotículas esteja ligado e verifique se uma garrafa de óleo gerador de gotículas está carregada para posicionar E do convés de instrumentos. Em seguida, clique em Configurar placa de amostra na tela sensível ao toque. Depois de selecionar todas as colunas na placa de amostra contendo as amostras ou espaços em branco, clique em OK para confirmar a configuração da placa.
Em seguida, carregue os cartuchos do gerador de gotículas na posição B no convés de instrumentos para que todas as luzes fiquem verdes e coloque uma calha de resíduos de ponta vazia na posição C.Em seguida, carregue as caixas de ponta do filtro com tampas removidas para a posição D no palco do instrumento para que todas as luzes fiquem verdes. Em seguida, remova o selo adesivo antes de carregar a placa de amostra para posicionar F do convés de instrumentos para que a luz fique verde. Carregue também uma placa vazia de coleta de gotículas de 96 poços colocada em um bloco frio, pré-resfriada a menos 20 graus Celsius, na posição G para que a luz fique verde.
Clique em Iniciar geração de gotículas na tela sensível ao toque do instrumento e a tampa do gerador de gotas será fechada automaticamente. Quando a geração de gotículas estiver concluída, verifique visualmente a placa de coleta de amostras para confirmar que uma camada de emulsão de gotículas está presente acima da fase de óleo em cada poço. Em seguida, ligue o selador de placas e defina a temperatura para 180 graus Celsius e o tempo de vedação para cinco segundos.
Permita que a máquina atinja a temperatura de funcionamento. Em seguida, coloque a placa de coleta de amostras no suporte da placa do selador de placas e coloque uma nova vedação de folha na parte superior da placa com a linha vermelha voltada para cima. Quando o selador de placas atingir sua temperatura de operação, pressione ejetar na tela sensível ao toque do instrumento.
Depois de colocar o suporte da placa na gaveta do selador de placas, pressione o selo para fechar a gaveta. Quando a vedação estiver concluída, a gaveta será aberta automaticamente. Retire a placa selada e coloque-a no bloco frio.
Em seguida, desligue o selador de placas. Para executar a PCR, coloque a placa de coleta de gotículas selada em uma máquina de PCR com um bloco de poço profundo de 96. Após a conclusão da PCR, ligue o leitor de gotas e o computador conectado.
Carregue a placa com as amostras pós-PCR no suporte da placa leitora de gotículas. Mantendo a tampa da folha na placa de amostra, coloque a tampa na parte superior do suporte e prenda-a no lugar com clipes de bloqueio pretos. Em seguida, para abrir a tampa do leitor de gotículas, pressione o botão abrir/fechar.
Em seguida, carregue o suporte da placa leitora de gotículas com a placa de amostra na câmara do leitor e coloque-a firmemente na base magnética. Pressione o botão abrir/fechar novamente para fechar a tampa. Abra a interface do software de análise.
Selecione a guia Adicionar placa, clique em Adicionar placa e, em seguida, em Configurar placa. Na guia Informações da placa, insira um nome de placa, selecione Supermix para Sondas, Sem DUTP no menu suspenso Supermix e insira um nome de arquivo em Salvar arquivo de dados As.In guia Seleção de poços, realce os poços a serem analisados e clique em Incluir poços selecionados. Em seguida, na guia Informações do poço, selecione os poços a serem anotados.
Selecione Quantificação direta no menu suspenso Tipo de experimento. Em seguida, preencha as caixas de descrição da amostra, tipo de amostra e nome de destino e adicione notas de poço e/ou notas de chapa, conforme necessário. Em seguida, clique em Aplicar.
Quando a configuração da placa estiver concluída, clique em Iniciar Execução. Para a análise de resultados, selecione a guia Análise de Dados e abra o arquivo a ser analisado no menu Meus Arquivos de Dados. Em seguida, clique na guia Amplitude 1D para experimentos de cor única ou na guia Amplitude 2D para experimentos de duas cores.
Em seguida, selecione os poços que exigem limites. Use a ferramenta Modo de Linha de Limiar para aplicar manualmente o limite no espaço livre entre as populações positivas e negativas no gráfico de amplitude, garantindo que a mira seja colocada de tal forma que as quatro populações de gotículas sejam claramente separadas. Depois que o limite for aplicado a todas as amostras, exporte os resultados como um arquivo csv para análise posterior, clicando na guia Tabela de Dados, Importar/Exportar e selecionando Exportar Dados Visíveis para CSV.
Insira um nome de arquivo adequado e clique em Salvar. Os procedimentos de PCR e leitura de gotículas utilizados neste protocolo demonstraram a presença de populações claramente separadas de gotículas positivas e negativas, tanto no canal fam quanto no hexadecimal. Populações de DNA mitocondrial positivas para ambas as sondas também podem ser distinguidas de lisatos unicelulares.
Este método também mostrou que, para amostras com deleções no DNA mitocondrial, uma população mista de gotículas duplamente positivas e gotículas positivas apenas para a porção não excluída do DNA está presente. Este método tem sido usado com sucesso para contar o número de cópias de DNA mitocondrial por célula em uma variedade de células de mamíferos, incluindo oócitos de camundongos e células embrionárias primárias de camundongos. Além disso, em células com alta heteroplasmia de deleção, a população positiva para uma única sonda foi significativamente maior do que a população duplamente positiva.
No entanto, em células com heteroplasmia de baixa deleção, ambas as populações eram de tamanho semelhante. Portanto, resultados precisos sempre garantem que a geração de gotículas tenha sido bem-sucedida e que o limiar tenha sido aplicado adequadamente usando a visualização de amplitude 1D ou 2D. O lisado não utilizado pode ser usado para outros ensaios de célula única, como o pirosequenciamento, que pode medir a heteroplasmia do polimorfismo de nucleotídeo único.
O desenvolvimento desta técnica nos permitiu fazer medições precisas do número de cópias de DNA mitocondrial e da heteroplasmia de deleção em células individuais, o que anteriormente não era possível.
