このプロトコルは、個々の細胞に存在するミトコンドリアDNAのコピー数と特定のタイプのミトコンドリアDNA変異のレベルを正確に測定するために使用できます。以前の方法では、多くの細胞を含む組織サンプルでこれらの測定を正確に行うことができました。この手法の主な利点は、単一セルで同じ測定を行うことができることです。
この方法は、ミトコンドリアを研究する人に特に有用であり、この分野で幅広い用途があります。単一細胞の効果的な単離と溶解は、この技術の鍵です。シングルセルソーティングの経験は非常に役立ちます。
まず、本文に記載されているように、氷上でサンプルDNAを使用せずにPCR用のマスターミックスを準備します。短時間ボルテックスした後、調製したマスターミックスの必要量を液滴生成PCR96ウェルプレートの各ウェルに分配し、サンプルをフルカラムに配置する。次に、マスターミックスを不完全な列の空のウェルに追加して、テンプレート以外のコントロールとして使用します。
次に、入力DNAを各ウェルに追加して、各ウェルの総容量を22マイクロリットルにします。プレートを粘着プレートシールで密封し、2000RPMで1分間シェーカーに置きます。次に、プレートを摂氏4度で1分間1000倍Gで遠心分離してから、氷上に置きます。
液滴を生成するには、まず液滴発生器の電源がオンになっていることを確認し、液滴発生オイルのボトルが計器デッキの位置Eにロードされているかどうかを確認します。次に、タッチスクリーンの[サンプルプレートの構成]をクリックします。サンプルまたはブランクを含むサンプルプレートのすべての列を選択したら、[OK]をクリックしてプレートの構成を確認します。
次に、液滴発生器カートリッジを計器デッキのBの位置Bにロードして、すべてのライトが緑色に変わるようにし、空のチップ廃棄物トラフを位置Cに配置します。次に、サンプルプレートを計器デッキの位置Fにロードする前に粘着シールを取り外して、ライトが緑色に変わるようにします。また、空の液滴コレクション96ウェルプレートを、摂氏マイナス20度で予め冷却された位置Gのクールブロックに入れ、ライトが緑色に変わるようにロードします。
機器のタッチスクリーンで[液滴生成の開始]をクリックすると、液滴発生器の蓋が自動的に閉じます。液滴の生成が完了したら、サンプル収集プレートを目視で確認して、液滴エマルジョン層が各ウェルの油相の上に存在することを確認します。次に、プレートシーラーの電源を入れ、温度を摂氏180度に設定し、シール時間を5秒に設定します。
機械が動作温度に達するまで待ちます。次に、サンプル収集プレートをプレートシーラーのプレートホルダーに置き、赤い線を上に向けてプレートの上部に新しいホイルシールを置きます。プレートシーラーが動作温度に達したら、機器のタッチスクリーンでイジェクトを押します。
プレートホルダーをプレートシーラーの引き出しに入れた後、シールを押して引き出しを閉じます。シーリングが完了すると、引き出しが自動的に開きます。密封されたプレートを取り外し、コールドブロックの上に置きます。
次に、プレートシーラーをオフにします。PCRを実行するには、密封された液滴収集プレートを96ディープウェルブロックを備えたPCRマシンに入れます。PCRが完了したら、ドロップレットリーダーと接続されているコンピューターの電源を入れます。
PCR後のサンプルを含むプレートをドロップレットリーダープレートホルダーにロードします。サンプルプレートのホイル蓋をしたまま、カバーをホルダーの上部に置き、黒いロッククリップで所定の位置に固定します。次に、ドロップレットリーダーの蓋を開くには、開閉ボタンを押します。
次に、サンプルプレート付きのドロップレットリーダープレートホルダーをリーダーチャンバーにロードし、磁気ベースにしっかりと置きます。もう一度開閉ボタンを押して蓋を閉じます。解析ソフトウェアインターフェースを開きます。
[プレートの追加] タブを選択し、[プレートの追加]、[プレートの構成] の順にクリックします。[プレート情報]タブで、プレート名を入力し、[Supermix]ドロップダウンメニューから[プローブ用Supermix]、[DUTPなし]を選択し、[ウェル選択]タブ As.In[データファイルの保存]にファイル名を入力し、分析するウェルをハイライト表示して、[選択したウェルを含める]をクリックします。次に、[井戸情報]タブで、注釈を付ける井戸を選択します。
[実験タイプ]ドロップダウンメニューから[直接定量]を選択します。次に、サンプルの説明、サンプルタイプ、ターゲット名ボックスに入力し、必要に応じてウェルノートやプレートノートを追加します。次に、[適用] をクリックします。
プレートの構成が完了したら、[実行の開始] をクリックします。結果分析を行うには、[データ分析]タブを選択し、[マイデータファイル]メニューから分析するファイルを開きます。次に、単色実験の場合は「1D 振幅」タブ、2 色実験の場合は「2D 振幅」タブをクリックします。
次に、閾値化が必要なウェルを選択します。しきい値ラインモードツールを使用して、振幅プロット上の正と負の集団の間の空きスペースにしきい値を手動で適用し、4つの液滴集団が明確に分離されるように十字線が配置されるようにします。すべてのサンプルにしきい値が適用されたら、[データ テーブル] タブの [インポート/エクスポート] をクリックし、[表示データを CSV にエクスポート] を選択して、結果を csv ファイルとしてエクスポートし、さらに分析します。
適切なファイル名を入力し、[保存] をクリックします。このプロトコルで使用されたPCRおよび液滴読み取り手順は、ファムチャネルとヘキサチャネルの両方で、陽性および陰性の液滴の明確に分離された集団の存在を示しました。両方のプローブに対して陽性のミトコンドリアDNA集団も、単一細胞溶解物と区別することができた。
この方法はまた、ミトコンドリアDNAに欠失を有する試料について、二重陽性の液滴およびDNAの非欠失部分のみについて陽性の液滴の混合集団が存在することを示した。この方法は、マウス卵母細胞や初代マウス胚細胞を含むさまざまな哺乳類細胞の細胞あたりのミトコンドリアDNAコピー数をカウントするために成功裏に使用されています。さらに、高欠失ヘテロプラスミーを有する細胞では、単一プローブに対して陽性の集団は、二重陽性集団よりも有意に大きいことがわかった。
しかし、低欠失ヘテロプラスミーを有する細胞では、両方の集団は同様のサイズであった。したがって、正確な結果は、液滴の生成が成功し、1Dまたは2D振幅ビューを使用して閾値が適切に適用されていることを常に保証します。未使用のライセートは、一塩基多型ヘテロプラスミーを測定できるパイロシークエンシングなどの他のシングルセルアッセイに使用できます。
この技術の開発により、これまで不可能だった個々の細胞のミトコンドリアDNAコピー数と欠失ヘテロプラスミーを正確に測定できるようになりました。
