פרוטוקול זה יכול לשמש למדידה מדויקת של מספר העותקים של דנ"א מיטוכונדריאלי הנמצאים בתאים בודדים ואת הרמה של סוגים מסוימים של מוטציה בדנ"א המיטוכונדריאלי. שיטות קודמות יכולות לבצע מדידות אלה במדויק בדגימות רקמה המכילות תאים רבים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים לבצע את אותן מדידות בתאים בודדים.
שיטה זו שימושית במיוחד למי שחוקר מיטוכונדריה ויהיו לה יישומים נרחבים בתחום זה. בידוד יעיל ותזה של תאים בודדים הוא המפתח לטכניקה זו. ניסיון קודם עם מיון תאים בודדים יעזור מאוד.
כדי להתחיל, הכן את תערובת האב עבור PCR ללא DNA הדגימה על הקרח, כפי שמתואר בטקסט. לאחר מערבולת קצרה, הפיצו את הנפח הנדרש של תערובת האב המוכנה לכל באר של צלחת PCR 96-well מדור טיפות, תוך סידור הדגימות בעמודות מלאות. לאחר מכן, הוסף את תערובת האב לכל באר ריקה בעמודות לא שלמות לשימוש בהן כפקדים שאינם תבנית.
לאחר מכן הוסף את הדנ"א הקלט לכל באר כדי להפוך את הנפח הכולל של כל באר 22 מיקרוליטר. אטמו את הצלחת עם חותם צלחת דבק והניחו אותה על שייקר במהירות של 2000 סל"ד למשך דקה אחת. לאחר מכן צנטריפוגה של הצלחת ב 1000 פעמים G במשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס לפני הנחתה על קרח.
עבור יצירת טיפות, תחילה ודא כי מחולל הטיפות מופעל ובדוק אם בקבוק של שמן המייצר טיפות נטען למיקום E של סיפון המכשיר. לאחר מכן לחצו על 'קביעת תצורה של צלחת לדוגמה' במסך המגע. לאחר בחירת כל העמודות בלוח הדגימה המכילות את הדגימות או הריקים, לחץ על בסדר כדי לאשר את תצורת הלוחית.
לאחר מכן, טען את מחסניות מחולל הטיפות כדי למקם את B על סיפון המכשיר כך שכל האורות יהפכו לירוקים והניחו שוקת פסולת קצה ריקה למצב C.לאחר מכן טען תיבות קצה מסנן עם מכסים שהוסרו כדי למקם את D על במת המכשיר כך שכל האורות יהפכו לירוקים. לאחר מכן, הסר את חותם הדבק לפני טעינת צלחת הדגימה כדי למקם F של סיפון המכשיר כך שהאור יהפוך לירוק. כמו כן, טען אוסף טיפות ריק 96-באר צלחת המונחת לתוך בלוק קריר, מקורר מראש במינוס 20 מעלות צלזיוס, במיקום G כך שהאור הופך לירוק.
לחץ על התחל יצירת Droplet במסך המגע של המכשיר ומכסה מחולל הטיפות ייסגר באופן אוטומטי. לאחר השלמת ייצור הטיפות, בדקו את צלחת איסוף הדגימות באופן חזותי כדי לוודא ששכבת תחליב טיפות נמצאת מעל שלב השמן בכל באר. לאחר מכן, הפעילו את איטום הצלחת והגדירו את הטמפרטורה ל-180 מעלות צלזיוס ואטמו את הזמן לחמש שניות.
אפשר להתקן להגיע לטמפרטורת ההפעלה. לאחר מכן הניחו את צלחת איסוף הדגימה על מחזיק הצלחת של איטום הצלחת והניחו חותם נייר כסף טרי על החלק העליון של הצלחת כאשר הקו האדום פונה כלפי מעלה. כאשר איטום הצלחות הגיע לטמפרטורת ההפעלה שלו, לחץ על הוצא במסך המגע של המכשיר.
לאחר הנחת מחזיק הצלחת במגירה של איטום הצלחות, לחץ על SEAL כדי לסגור את המגירה. לאחר השלמת האיטום, המגירה תיפתח באופן אוטומטי. הסר את הצלחת האטומה והנח אותה על בלוק קר.
לאחר מכן כבה את איטום הצלחת. להפעלת ה-PCR, הניחו את צלחת איסוף הטיפות האטומה במכונת PCR עם בלוק עמוק של 96. לאחר השלמת ה-PCR, הפעל את קורא הטיפות ואת המחשב המחובר.
טען את הצלחת עם דגימות ה- PCR שלאחר מכן לתוך מחזיק צלחת קורא הטיפות. תוך שמירה על מכסה נייר הכסף על צלחת הדגימה, הניחו את המכסה על החלק העליון של המחזיק והדקו אותו במקומו באמצעות מהדקי נעילה שחורים. לאחר מכן, כדי לפתוח את מכסה קורא הטיפות, לחץ על לחצן הפתיחה/סגירה.
לאחר מכן טען את מחזיק צלחת קורא הטיפות עם צלחת הדגימה לתוך תא הקורא והנח אותו היטב על הבסיס המגנטי. לחץ שוב על לחצן הפתיחה/סגירה כדי לסגור את המכסה. פתח את ממשק תוכנת הניתוח.
בחר בכרטיסיה הוסף לוח, לחץ על הוסף צלחת ולאחר מכן על קביעת תצורה של לוח. בכרטיסייה 'פרטי לוחית', הזן שם לוחית, בחר Supermix עבור בדיקות, ללא DUTP מהתפריט הנפתח Supermix והזן שם קובץ תחת שמור קובץ נתונים As.In הכרטיסיה בחירת בארות, סמן את הבארות לניתוח ולחץ על כלול בארות שנבחרו. לאחר מכן, בכרטיסייה מידע באר, בחר את הבארות שיש להוסיף להן ביאורים.
בחר כימות ישיר מהתפריט הנפתח סוג ניסוי. לאחר מכן אכלס את תיאור הדוגמה, סוג הדגימה ותיבות שם היעד, והוסף הערות באר או הערות לוח לפי הצורך. לאחר מכן לחצו על 'החל'.
לאחר השלמת תצורת הצלחת, לחץ על התחל הפעלה. לניתוח תוצאות, בחר בכרטיסיה ניתוח נתונים ופתח את הקובץ לניתוח מתפריט קבצי הנתונים שלי. לאחר מכן לחץ על הכרטיסיה משרעת 1D עבור ניסויים בצבע יחיד, או על הכרטיסייה משרעת דו-ממדית עבור ניסויים בשני צבעים.
לאחר מכן, בחר את הבארות הדורשות סף. השתמש בכלי מצב קו סף כדי להחיל ידנית את הסף במרחב הברור בין האוכלוסייה החיובית והשלילית בחלקת המשרעת, ולהבטיח שהכוונת תוצב כך שארבע אוכלוסיות הטיפות מופרדות בבירור. לאחר החלת הסף על כל הדוגמאות, ייצא את התוצאות כקובץ csv לניתוח נוסף על ידי לחיצה על הכרטיסייה טבלת נתונים, ייבוא/ייצוא ובחירה באפשרות ייצוא נתונים גלויים ל- CSV.
הזן שם קובץ מתאים ולחץ על שמור. נהלי קריאת ה-PCR והטיפות ששימשו בפרוטוקול זה הדגימו את נוכחותן של אוכלוסיות מופרדות בבירור של טיפות חיוביות ושליליות, הן בערוצי fam והן בערוצי hex. ניתן גם להבחין בין אוכלוסיות דנ"א מיטוכונדריאליות חיוביות לשתי הגשושיות לבין ליזטים חד-תאיים.
שיטה זו הראתה גם כי עבור דגימות עם מחיקות בדנ"א המיטוכונדריאלי, קיימת אוכלוסייה מעורבת של טיפות חיוביות כפולות וטיפות חיוביות רק עבור החלק שלא נמחק של הדנ"א. שיטה זו שימשה בהצלחה לספירת מספר עותק הדנ"א המיטוכונדריאלי לכל תא במגוון תאי יונקים, כולל ביציות עכבר ותאים עובריים ראשוניים של עכברים. יתר על כן, בתאים עם הטרופלזמה עם מחיקה גבוהה, האוכלוסייה החיובית עבור בדיקה בודדת נמצאה גדולה משמעותית מהאוכלוסייה החיובית הכפולה.
עם זאת, בתאים עם הטרופלזמה עם מחיקה נמוכה, שתי האוכלוסיות היו בגודל דומה. כך שתוצאות מדויקות תמיד מבטיחות שיצירת הטיפות הייתה מוצלחת ושהסף יושם כראוי באמצעות תצוגת המשרעת החד-ממדית או הדו-ממדית. ליזאט שאינו בשימוש יכול לשמש עבור בדיקות אחרות של תאים בודדים, כגון pyrosequencing, אשר יכול למדוד הטרופלזמה פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד.
הפיתוח של טכניקה זו אפשר לנו לבצע מדידות מדויקות של מספר עותק DNA מיטוכונדריאלי, ומחיקה heteroplasmy בתאים בודדים, אשר בעבר לא היה אפשרי.
