本视频中描述的是一种用于创建和使用称为 Drydux 的干大孔藻酸盐支架的方案，可有效促进活化 T 细胞的转导。Drydux 旨在代替接种病毒的逆转录凝连蛋白包被板的金标准棘刺，并简化细胞转导过程。Drydux 的转导效率可与 RetroNectin 包被板上的脊髓相媲美，并且是传统转导方法更便宜、更方便的替代方案。
首先，制备0.4%的葡萄糖酸钙溶液。将无菌过滤去离子水加入烧杯中的D-葡萄糖酸钙中。中速搅拌直至葡萄糖酸钙溶解，大约需要 1 1/2 小时。
溶解后，无菌过滤钙-D-葡萄糖酸溶液。该溶液可以在室温下储存。接下来，准备2%海藻酸盐溶液。
这可以使用螺旋盖小瓶或烧杯来完成。两者都将在此处显示。小心地将超纯海藻酸盐添加到容器中。
在海藻酸盐中加入适量的去离子水。选择不会妨碍混合的最大搅拌棒并将其添加到容器中。将溶液搅拌到海藻酸盐溶解，这大约需要一个小时。
如果容器侧面有任何大的藻酸盐团块，请将容器侧向倾斜以将其移开。小团块会在一小时内溶解，无需担心。一旦2%海藻酸盐溶液溶解，降低搅拌速度。
将等体积的钙-D-葡萄糖酸盐溶液缓慢添加到海藻酸盐溶液中。缓慢添加将有助于防止形成交联团块。加入葡萄糖酸钙溶液后，加快搅拌速度，剧烈搅拌15分钟。
将容器侧向倾斜以去除可能已形成的任何团块。剧烈搅拌15分钟后，确保溶液中没有团块。将溶液移液到48孔板或24孔板中。
对于 48 孔板，将 300 微升移液到每个孔中。确保缓慢施洗并经常更换吸头，因为溶液会很粘稠，并且可能会粘在吸头上。对于 24 孔板，将一毫升移入每个孔中。
同样，缓慢施放，并经常更换移液器吸头。盖上孔板，在负20摄氏度下冷冻过夜。通过取下盖子并用湿巾和橡皮筋固定顶部来准备冻干机的板。
将板放入冻干管中，然后放在冻干机上72小时。72小时后，从冻干机中取出板。支架现在已准备好用于转导。
如果不立即使用脚手架，请用石蜡膜密封板并储存在四摄氏度下，直到需要为止。对于长期储存，除了用封口膜密封外，建议对板进行真空密封。通过将两毫升病毒溶液通过离心过滤器以1， 500g离心10分钟来浓缩病毒上清液。
每个支架需要 100 到 200 微升浓缩病毒。如果浓缩的病毒溶液体积大于 200 微升，再旋转几分钟。对于每个支架，将 100 万个活化的 T 细胞悬浮在 50 微升的完整细胞培养基中等分试样。
将浓缩的病毒添加到细胞悬液中。对于48孔支架，细胞病毒悬浮液的总体积不应超过200微升，对于24孔支架，细胞病毒悬浮液的总体积不应超过350微升。将细胞病毒混合物滴加到干支架的顶部。
对于阴性对照实验，使用完整的细胞培养基代替浓缩的病毒。将此细胞悬液添加到干支架的顶部。将支架在 37 摄氏度的细胞培养箱中孵育 45 至 60 分钟。
从培养箱中取出支架。在此期间，支架应完全吸收溶液。为了诱导增殖，向每个孔中加入补充有IL-7和IL-15的完整细胞培养基。
也可以使用IL-2。对于 24 孔支架，添加一毫升。对于 48 孔支架，添加 500 微升。
在 37 摄氏度下孵育 72 小时。细胞将在72小时内增殖，这可能会使培养基变成橙色。从每个孔中取出多余的培养基。
要从支架中分离细胞，请向每个支架添加0.25摩尔EDTA溶液。24孔支架加1毫升，48孔支架加300微升。让盘子静置，或轻轻搅拌三到四分钟。
一旦大部分溶解，在孔内轻轻移入和移出。可能需要一些进出移液步骤才能完全溶解支架。将溶液转移到15毫升离心管中。
用PBS清洗细胞两次。向每个离心管中加入12毫升PBS。以400克离心五分钟。
细胞沉淀将在管底部形成。吸出上清液，并重复洗涤。每次洗涤时都要小心完全去除上清液，因为去除所有EDTA至关重要。
用PBS第二次洗涤后，细胞沉淀即可进行分析。采用流式细胞术测定各组转导效率。非转导细胞用作阴性对照，未显示转导。
接种在没有GFP逆转录病毒的支架上的细胞也没有显示转导。Drydux组将活化的细胞接种到干燥的大孔藻酸盐支架上，显示出85%的转导，略低于RetroNectin组。这些结果表明，Drydux支架通过逆转录病毒基因转移有效地转导细胞，而无需逆转录菌素包被的平板进行棘刺。
Drydux支架表现出与逆转录菌素相当的高转导效率，为转导T细胞提供了一种替代方法。由于制造Drydux支架的成本低，该过程有可能显着降低CAR-T细胞疗法的成本。
