Bu videoda açıklanan, aktif T hücrelerinin transdüksiyonunu verimli bir şekilde teşvik eden Drydux olarak bilinen kuru makrogözenekli aljinat iskelelerinin oluşturulması ve kullanılması için bir protokoldür. Drydux, virüs tohumlanmış RetroNektin kaplı plakaların altın standart spinokülasyonunun yerine kullanılmak üzere tasarlanmıştır ve hücrelerin dönüştürülmesi işlemini basitleştirir. Drydux, RetroNektin kaplı plakalarda spinokülasyonla karşılaştırılabilir bir transdüksiyon verimliliğine sahiptir ve geleneksel transdüksiyon yöntemine daha ucuz ve daha uygun bir alternatif olarak hizmet eder.
İlk önce,% 0.4'lük bir kalsiyum-D-glukonat çözeltisi hazırlayın. Bir beherde kalsiyum-D-glukonata steril filtrelenmiş DI suyu ekleyin. Kalsiyum-D-glukonat çözünene kadar orta hızda karıştırın, bu da yaklaşık 1 1/2 saat sürer.
Çözündükten sonra, kalsiyum-D-glukonat çözeltisini steril olarak filtreleyin. Bu çözelti oda sıcaklığında saklanabilir. Daha sonra,% 2'lik bir aljinat çözeltisi hazırlayın.
Bu, bir vidalı kapak şişesi veya bir beher kullanılarak gerçekleştirilebilir. Her ikisi de burada gösterilecektir. Ultra saf aljinatı damara dikkatlice ekleyin.
Aljinata uygun miktarda DI suyu ekleyin. Karıştırmayı engellemeyecek mümkün olan en büyük karıştırma çubuğunu seçin ve kaba ekleyin. Aljinat çözünene kadar çözeltiyi yüksekte karıştırın, bu da yaklaşık bir saat sürer.
Geminin yan tarafında büyük aljinat kümeleri varsa, bunları yerinden çıkarmak için kabı yana doğru eğin. Küçük kümeler saat içinde çözülür ve endişe kaynağı değildir. % 2 aljinat çözeltisi çözündükten sonra, karıştırma hızını azaltın.
Aljinat çözeltisine yavaşça eşit miktarda kalsiyum-D-glukonat çözeltisi ekleyin. Yavaşça eklemek, çapraz bağlanan kümelerin oluşmasını önlemeye yardımcı olacaktır. Kalsiyum-glukonat çözeltisi eklendiğinde, karıştırma hızını artırın ve 15 dakika boyunca kuvvetlice karıştırın.
Oluşmuş olabilecek kümeleri çıkarmak için kabı yana doğru eğin. 15 dakika boyunca kuvvetlice karıştırdıktan sonra, çözeltide küme olmadığından emin olun. Çözeltiyi 48 veya 24 delikli bir plakaya pipetleyin.
48 delikli bir plaka için, her bir kuyucuğa 300 mikrolitre pipet yerleştirin. Çözelti viskoz olacağından ve uca yapışabileceğinden, yavaşça döktüğünüzden ve uçları sık sık değiştirdiğinizden emin olun. 24 delikli bir plaka için, her bir kuyucuğa bir mililitre pipet yerleştirin.
Yine, yavaşça dökün ve pipet uçlarını sık sık değiştirin. Kuyu plakalarını bir kapakla örtün ve gece boyunca negatif 20 santigrat derecede dondurun. Kapakları çıkararak ve üstünü mendil ve lastik bantlarla sabitleyerek liyofilizatör için plakaları hazırlayın.
Plakaları liyofilizatör tüpüne yerleştirin ve 72 saat boyunca liyofilizatörü takın. 72 saat sonra, plakayı liyofilizatörden çıkarın. İskeleler artık aktarma için kullanılmaya hazırdır.
İskeleleri hemen kullanmıyorsanız, plakayı Parafilm ile kapatın ve ihtiyaç duyulana kadar dört santigrat derecede saklayın. Uzun süreli depolama için, Parafilm ile sızdırmazlığa ek olarak plakanın vakumla kapatılması önerilir. İki mililitre viral çözeltiyi 10 dakika boyunca 1.500 g'da bir santrifüj filtreden geçirerek viral süpernatantı konsantre edin.
İskele başına 100 ila 200 mikrolitre konsantre virüse ihtiyaç vardır. Konsantre virüs çözeltisi hacmi 200 mikrolitreden büyükse birkaç dakika daha döndürün. Her iskele için, 50 mikrolitre tam hücre kültürü ortamında asılı olan 1 milyon aktif T hücresinden oluşan bir aliquot yapın.
Konsantre virüsü hücre süspansiyonuna ekleyin. Hücre virüsü süspansiyonunun toplam hacmi, 48 kuyulu bir iskele için 200 mikrolitreyi veya 24 kuyulu bir iskele için 350 mikrolitreyi geçmemelidir. Hücre virüsü karışımını kuru iskelenin üstüne damla damla ekleyin.
Negatif kontrol deneyleri için, konsantre virüs yerine tam hücre kültürü ortamı kullanın. Bu hücre süspansiyonunu kuru iskelenin üstüne ekleyin. Hücre kültürü inkübatöründeki iskeleleri 45 ila 60 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
İskeleleri inkübatörden çıkarın. İskeleler bu süre zarfında çözeltiyi tamamen emmelidir. Proliferasyonu indüklemek için, her bir kuyucuğa IL-7 ve IL-15 ile desteklenmiş tam hücre kültürü ortamı ekleyin.
IL-2 de kullanılabilir. 24 kuyulu bir iskele için bir mililitre ekleyin. 48 kuyulu bir iskele için 500 mikrolitre ekleyin.
72 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücreler 72 saat içinde çoğalır ve bu da medyayı turuncuya çevirebilir. Her bir kuyu boşluğundan fazla medyayı çıkarın.
Hücreleri iskeleden izole etmek için, her iskeleye 0.25 molar EDTA çözeltisi ekleyin. 24 kuyulu iskeleler için bir mililitre veya 48 delikli iskeleler için 300 mikrolitre ekleyin. Tabağın oturmasına izin verin veya üç ila dört dakika boyunca hafifçe çalkalayın.
Çoğunlukla çözüldükten sonra, kuyunun içine yavaşça girip çıkın. İskeleyi tamamen çözmek için birkaç giriş ve çıkış pipetleme adımı gerekebilir. Çözeltiyi 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.
Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Her santrifüj tüpüne 12 mililitre PBS ekleyin. Beş dakika boyunca 400 g'da santrifüj.
Tüpün dibinde bir hücre peleti oluşacaktır. Süpernatant çözeltiyi aspire edin ve yıkamayı tekrarlayın. Tüm EDTA'dan kurtulmak çok önemli olduğu için her yıkamada süpernatantı tamamen çıkarmaya dikkat edin.
PBS ile ikinci kez yıkandıktan sonra, hücre peleti analiz için hazırdır. Her grubun transdüksiyon verimliliğini belirlemek için akım sitometrisi kullanıldı. Transdüke edilmemiş hücreler negatif kontrol olarak kullanıldı ve transdüksiyon göstermedi.
GFP retrovirüsü olmayan iskelelere tohumlanan hücreler de transdüksiyon göstermedi. Kuru makrogözenekli aljinat iskelelerine tohumlanmış aktive olmuş hücreleri aktive eden Drydux grubu, RetroNectin grubundan sadece daha düşük% 85 transdüksiyon gösterdi. Bu sonuçlar, Drydux iskelelerinin, RetroNektin kaplı plakaların spinokülasyonuna gerek kalmadan retroviral gen transferi yoluyla hücreleri etkili bir şekilde dönüştürdüğünü göstermektedir.
Drydux iskeleleri, RetroNectin ile karşılaştırılabilir yüksek iletim verimliliği sergiler ve T hücrelerinin dönüştürülmesi için alternatif bir yöntem sunar. Drydux iskelelerinin düşük üretim maliyeti nedeniyle, bu işlem CAR T hücresi tedavilerinin maliyetini önemli ölçüde düşürme potansiyeline sahiptir.
