Cette vidéo décrit un protocole pour créer et utiliser des échafaudages d’alginate macroporeux secs connus sous le nom de Drydux qui favorisent efficacement la transduction des lymphocytes T activés. Drydux est conçu pour être utilisé à la place de la spinoculation de référence des plaques enrobées de rétroNectine ensemencées avec du virus et simplifie le processus de transmission des cellules. Drydux a une efficacité de transduction comparable à celle de la spinoculation sur plaques revêtues de rétronectine et constitue une alternative moins chère et plus pratique à la méthode de transduction conventionnelle.
Tout d’abord, préparez une solution à 0,4% de gluconate de calcium-D. Ajouter de l’eau DI filtrée stérile au gluconate de calcium dans un bécher. Remuer à vitesse moyenne jusqu’à ce que le gluconate de calcium soit dissous, ce qui prend environ 1 1/2 heure.
Une fois dissous, filtrer stérile la solution de calcium-D-gluconate de calcium. Cette solution peut être conservée à température ambiante. Ensuite, préparez une solution d’alginate à 2%.
Cela peut être accompli à l’aide d’un flacon à bouchon à vis ou d’un bécher. Les deux seront montrés ici. Ajouter soigneusement l’alginate ultrapur dans le récipient.
Ajouter la quantité appropriée d’eau DI à l’alginate. Choisissez la plus grande barre d’agitation possible qui n’empêchera pas le mélange et ajoutez-la au récipient. Remuer la solution à puissance élevée jusqu’à ce que l’alginate se dissolve, ce qui prend environ une heure.
S’il y a de gros amas d’alginate sur le côté du vaisseau, inclinez le vaisseau latéralement pour les déloger. Les petits touffes se dissolvent au fil des heures et ne sont pas préoccupants. Une fois la solution d’alginate à 2 % dissoute, réduire la vitesse d’agitation.
Ajouter lentement un volume égal de la solution de gluconate de calcium D à la solution d’alginate. L’ajouter lentement aidera à empêcher la formation de touffes de réticulation. Lorsque la solution de gluconate de calcium a été ajoutée, augmenter la vitesse d’agitation et remuer vigoureusement pendant 15 minutes.
Inclinez le vaisseau latéralement pour enlever les touffes qui ont pu se former. Après avoir agité vigoureusement pendant 15 minutes, assurez-vous qu’il n’y a pas de touffes dans la solution. Pipeter la solution dans une plaque de 48 ou 24 puits.
Pour une plaque de 48 puits, pipeter 300 microlitres dans chaque puits. Assurez-vous de lancer lentement et de changer souvent les pointes, car la solution sera visqueuse et pourrait coller à la pointe. Pour une plaque de 24 puits, pipeter un millilitre dans chaque puits.
Encore une fois, lancez lentement et changez souvent les pointes des pipettes. Couvrir les plaques de puits avec un couvercle et congeler à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit. Préparez les plaques pour le lyophile en retirant les couvercles et en fixant le dessus avec des lingettes et des élastiques.
Placez les plaques dans le tube lyophiliseur et mettez le lyophiliseur pendant 72 heures. Après 72 heures, retirez la plaque du lyophiliseur. Les échafaudages sont maintenant prêts à être utilisés pour la transduction.
Si vous n’utilisez pas les échafaudages immédiatement, scellez la plaque avec Parafilm et conservez à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Pour un stockage à long terme, il est recommandé de sceller la plaque sous vide en plus de l’étanchéité avec Parafilm. Concentrer le surnageant viral en centrifugeant deux millilitres de solution virale à travers un filtre centrifuge à 1 500 g pendant 10 minutes.
100 à 200 microlitres de virus concentré sont nécessaires par échafaudage. Faites tourner pendant quelques minutes supplémentaires si le volume de la solution virale concentrée est supérieur à 200 microlitres. Pour chaque échafaudage, fabriquer une partie aliquote de 1 million de lymphocytes T activés en suspension dans 50 microlitres de milieux de culture cellulaire complets.
Ajouter le virus concentré à la suspension cellulaire. Le volume total de la suspension du virus cellulaire ne doit pas dépasser 200 microlitres pour un échafaudage de 48 puits, ou 350 microlitres pour un échafaudage de 24 puits. Ajouter le mélange de virus cellulaires goutte à goutte au sommet de l’échafaudage sec.
Pour les expériences de contrôle négatif, utiliser des milieux de culture cellulaire complets à la place du virus concentré. Ajouter cette suspension cellulaire au sommet de l’échafaudage sec. Incuber les échafaudages dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius pendant 45 à 60 minutes.
Retirez les échafaudages de l’incubateur. Les échafaudages doivent absorber complètement la solution pendant ce temps. Pour induire la prolifération, ajouter des milieux de culture cellulaire complets supplémentés en IL-7 et IL-15 à chaque puits.
IL-2 peut également être utilisé. Pour un échafaudage de 24 puits, ajoutez un millilitre. Pour un échafaudage de 48 puits, ajoutez 500 microlitres.
Incuber à 37 degrés Celsius pendant 72 heures. Les cellules vont proliférer au cours des 72 heures, ce qui peut rendre le média orange. Retirez l’excès de média de chaque puits.
Pour isoler les cellules de l’échafaudage, ajoutez une solution d’EDTA 0,25 molaire à chaque échafaudage. Ajoutez un millilitre pour les échafaudages à 24 puits, ou 300 microlitres pour les échafaudages à 48 puits. Laissez reposer l’assiette ou agitez doucement pendant trois à quatre minutes.
Une fois la plus grande partie dissoute, introduire et sortir doucement à l’intérieur du puits. Quelques étapes de pipetage peuvent être nécessaires pour dissoudre complètement l’échafaudage. Transférer la solution dans un tube à centrifuger de 15 millilitres.
Lavez les cellules deux fois avec du PBS. Ajouter 12 millilitres de PBS à chaque tube de centrifugation. Centrifuger à 400 g pendant cinq minutes.
Une pastille de cellule se formera au fond du tube. Aspirer la solution surnageante et répéter le lavage. Veillez à éliminer complètement le surnageant à chaque lavage, car il est crucial de se débarrasser de tout l’EDTA.
Après un deuxième lavage avec du PBS, le granulé de cellule est prêt pour l’analyse. La cytométrie de flux a été utilisée pour déterminer l’efficacité de transduction de chaque groupe. Des cellules non transduites ont été utilisées comme témoin négatif et n’ont montré aucune transduction.
Les cellules ensemencées sur des échafaudages sans rétrovirus GFP n’ont également montré aucune transduction. Le groupe Drydux, qui avait activé des cellules ensemencées sur les échafaudages d’alginate macroporeux secs, a montré une transduction de 85%, juste inférieure au groupe RetroNectine. Ces résultats démontrent que les échafaudages Drydux transduisent efficacement les cellules par transfert de gènes rétroviraux sans avoir besoin de spinoculation des plaques recouvertes de rétroNectine.
Les échafaudages Drydux présentent une efficacité de transduction élevée comparable à celle de la rétroNectine, offrant une méthode alternative pour transduire les lymphocytes T. En raison du faible coût de fabrication des échafaudages Drydux, ce processus a le potentiel de réduire considérablement le coût des thérapies par cellules CAR-T.
