الموصوف في هذا الفيديو هو بروتوكول لإنشاء واستخدام سقالات الجينات الجافة التي يسهل اختراقها والمعروفة باسم Drydux والتي تعزز بكفاءة نقل الخلايا التائية المنشطة. تم تصميم Drydux ليتم استخدامه بدلا من الدوران القياسي الذهبي للألواح المطلية ب RetroNectin المزروعة بالفيروس ويبسط عملية تحويل الخلايا. يتمتع Drydux بكفاءة نقل مماثلة للدوران على الألواح المطلية ب RetroNectin ، ويعمل كبديل أرخص وأكثر ملاءمة لطريقة النقل التقليدية.
أولا ، قم بإعداد محلول 0.4٪ من الكالسيوم-D-gluconate. أضف ماء DI المعقم المصفى إلى الكالسيوم-D-gluconate في دورق. يقلب على سرعة متوسطة حتى يذوب الكالسيوم-D-gluconate ، الأمر الذي يستغرق حوالي 1 1/2 ساعة.
بمجرد إذابته ، قم بتصفية محلول الكالسيوم D-gluconate المعقم. يمكن تخزين هذا الحل في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول ألجينات 2٪.
يمكن تحقيق ذلك باستخدام قارورة غطاء لولبي أو دورق. سيتم عرض كلاهما هنا. أضف بعناية الجينات فائقة النقاء إلى الوعاء.
أضف الكمية المناسبة من ماء DI إلى الجينات. اختر أكبر شريط تحريك ممكن لن يعيق الخلط وأضفه إلى الوعاء. حرك المحلول على درجة عالية حتى يذوب الجينات ، الأمر الذي يستغرق حوالي ساعة واحدة.
إذا كان هناك أي كتل ألجينات كبيرة على جانب الوعاء ، فقم بإمالة الوعاء جانبيا لإزاحتها. سوف تذوب الكتل الصغيرة على مدار الساعة ، ولا تدعو للقلق. بمجرد أن يذوب محلول الجينات 2٪ ، قلل من سرعة التحريك.
أضف ببطء حجما متساويا من محلول غلوكونات الكالسيوم-D إلى محلول الجينات. ستساعد إضافته ببطء على منع تكون كتل الربط المتقاطع. عند إضافة محلول غلوكونات الكالسيوم ، قم بزيادة سرعة التحريك ، وحركه بقوة لمدة 15 دقيقة.
قم بإمالة الوعاء جانبيا لإزالة أي كتل قد تكون تشكلت. بعد التقليب بقوة لمدة 15 دقيقة ، تأكد من عدم وجود كتل في المحلول. ماصة الحل في لوحة 48 ، أو 24 بئر.
للحصول على لوحة من 48 بئرا ، ماصة 300 ميكرولتر في كل بئر. تأكد من الإلقاء ببطء وتغيير النصائح في كثير من الأحيان ، لأن المحلول سيكون لزجا ، وقد يلتصق بالطرف. للحصول على لوحة من 24 بئرا ، ماصة ملليلتر واحد في كل بئر.
مرة أخرى ، يلقي ببطء ، وتغيير نصائح ماصة في كثير من الأحيان. قم بتغطية ألواح البئر بغطاء ، وقم بتجميدها عند سالب 20 درجة مئوية طوال الليل. قم بإعداد الألواح لجهاز التجفيف بالتجميد عن طريق إزالة الأغطية وتأمين الجزء العلوي بالمناديل والأربطة المطاطية.
ضع الألواح في أنبوب المجفف بالتجميد ، وضعها على جهاز التجفيف بالتجميد لمدة 72 ساعة. بعد 72 ساعة ، أخرج اللوحة من جهاز التجفيد. السقالات جاهزة الآن لاستخدامها في النقل.
إذا لم تستخدم السقالات على الفور ، أغلق الطبق ب Parafilm واحفظه في درجة حرارة أربع درجات مئوية لحين الحاجة. للتخزين طويل الأجل ، يوصى بإغلاق اللوحة بالمكنسة الكهربائية بالإضافة إلى الختم باستخدام Parafilm. تركيز طاف الفيروسية عن طريق الطرد المركزي اثنين ملليلتر من محلول فيروسي من خلال مرشح الطرد المركزي في 1،500 غرام لمدة 10 دقائق.
هناك حاجة إلى 100 إلى 200 ميكرولتر من الفيروس المركز لكل سقالة. تدور لبضع دقائق إضافية إذا كان حجم محلول الفيروس المركز أكبر من 200 ميكرولتر. لكل سقالة ، اصنع حصصا من 1 مليون خلية تائية نشطة معلقة في 50 ميكرولتر من وسائط زراعة الخلايا الكاملة.
أضف الفيروس المركز إلى تعليق الخلية. يجب ألا يتجاوز الحجم الكلي لتعليق فيروس الخلية 200 ميكرولتر لسقالة 48 بئرا ، أو 350 ميكرولتر لسقالة 24 بئرا. أضف خليط فيروس الخلية قطرة إلى الجزء العلوي من السقالة الجافة.
بالنسبة لتجارب التحكم السلبية ، استخدم وسائط زراعة الخلايا الكاملة بدلا من الفيروس المركز. أضف معلق الخلية هذا إلى الجزء العلوي من السقالة الجافة. احتضان السقالات في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 45 إلى 60 دقيقة.
إزالة السقالات من الحاضنة. يجب أن تمتص السقالات المحلول بالكامل خلال هذا الوقت. للحث على الانتشار ، أضف وسائط زراعة الخلايا الكاملة المكملة ب IL-7 و IL-15 إلى كل بئر.
يمكن أيضا استخدام IL-2. للحصول على سقالة 24 بئرا ، أضف ملليلتر واحد. للحصول على سقالة 48 بئرا ، أضف 500 ميكرولتر.
احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة. سوف تتكاثر الخلايا على مدار 72 ساعة ، مما قد يحول الوسائط إلى اللون البرتقالي. قم بإزالة الوسائط الزائدة من كل بئر.
لعزل الخلايا عن السقالة ، أضف محلول EDTA 0.25 المولي إلى كل سقالة. أضف ملليلتر واحد للسقالات ذات 24 بئرا ، أو 300 ميكرولتر للسقالات ذات 48 بئرا. دع الطبق يجلس ، أو حرك بلطف لمدة ثلاث إلى أربع دقائق.
بمجرد أن يذوب في الغالب ، ماصة داخل وخارج بلطف داخل البئر. قد تكون بعض خطوات السحب للداخل والخارج ضرورية لإذابة السقالة بالكامل. نقل الحل إلى أنبوب طرد مركزي 15 ملليلتر.
اغسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني. أضف 12 ملليلتر من PBS إلى كل أنبوب طرد مركزي. جهاز طرد مركزي عند 400 غرام لمدة خمس دقائق.
سوف تتشكل بيليه الخلية في الجزء السفلي من الأنبوب. نضح محلول طافي ، وكرر الغسيل. احرص على إزالة المادة الطافية تماما مع كل غسلة لأنه من الضروري التخلص من كل EDTA.
بعد الغسيل باستخدام PBS مرة ثانية ، تكون حبيبات الخلية جاهزة للتحليل. تم استخدام قياس التدفق الخلوي لتحديد كفاءة النقل لكل مجموعة. تم استخدام الخلايا غير المنقولة كعنصر تحكم سلبي ، ولم تظهر أي نقل.
كما لم تظهر الخلايا المصنفة على سقالات بدون فيروس GFP القهقري أي نقل. أظهرت مجموعة Drydux ، التي نشطت الخلايا المزروعة على سقالات الجينات الجافة التي يسهل اختراقها ، 85٪ من النقل ، أي أقل بقليل من مجموعة RetroNectin. توضح هذه النتائج أن سقالات Drydux تنقل الخلايا بشكل فعال عن طريق نقل الجينات الفيروسية القهقرية دون الحاجة إلى تدوير الصفائح المطلية ب RetroNectin.
تظهر سقالات Drydux كفاءة نقل عالية مماثلة ل RetroNectin ، مما يوفر طريقة بديلة لتحويل الخلايا التائية. نظرا لانخفاض تكلفة تصنيع سقالات Drydux ، فإن هذه العملية لديها القدرة على خفض تكلفة علاجات الخلايا التائية CAR T-cell بشكل كبير.
