En este video se describe un protocolo para crear y usar andamios de alginato macroporoso seco conocidos como Drydux que promueven eficientemente la transducción de células T activadas. Drydux está diseñado para ser utilizado en lugar de la espinoculación estándar de oro de placas recubiertas con RetroNectin sembradas con virus y simplifica el proceso de transducción de células. Drydux tiene una eficiencia de transducción comparable a la espinoculación en placas recubiertas de RetroNectin, y sirve como una alternativa más barata y conveniente al método de transducción convencional.
Primero, prepare una solución al 0,4% de D-gluconato de calcio. Agregue agua DI filtrada estéril al D-gluconato de calcio en un vaso de precipitados. Revuelva a velocidad media hasta que el D-gluconato de calcio se haya disuelto, lo que toma aproximadamente 1 1/2 horas.
Una vez disuelto, filtre estéril la solución de calcio-D-gluconato. Esta solución se puede almacenar a temperatura ambiente. A continuación, prepare una solución de alginato al 2%.
Esto se puede lograr usando un vial de tapa de rosca o un vaso de precipitados. Ambos se mostrarán aquí. Agregue cuidadosamente el alginato ultrapuro al recipiente.
Agregue la cantidad adecuada de agua DI al alginato. Elija la barra de agitación más grande posible que no impida la mezcla y agréguela al recipiente. Revuelva la solución a fuego alto hasta que el alginato se disuelva, lo que toma aproximadamente una hora.
Si hay grupos grandes de alginato en el costado del recipiente, incline el recipiente hacia los lados para desalojarlos. Los pequeños grupos se disolverán durante la hora y no son motivo de preocupación. Una vez que la solución de alginato al 2% se disuelve, reduzca la velocidad de agitación.
Agregue lentamente un volumen igual de la solución de calcio-D-gluconato a la solución de alginato. Agregarlo lentamente ayudará a evitar que se formen grupos de reticulación. Cuando se haya agregado la solución de gluconato de calcio, aumente la velocidad de agitación y revuelva vigorosamente durante 15 minutos.
Incline el vaso hacia los lados para eliminar cualquier grumo que pueda haberse formado. Después de remover vigorosamente durante 15 minutos, asegúrese de que no haya grumos en la solución. Pipeta la solución en una placa de 48 o 24 pocillos.
Para una placa de 48 pocillos, pipetear 300 microlitros en cada pocillo. Asegúrese de fundir lentamente y cambie las puntas con frecuencia, ya que la solución será viscosa y puede adherirse a la punta. Para una placa de 24 pocillos, pipetear un mililitro en cada pocillo.
Una vez más, colar lentamente y cambiar las puntas de la pipeta con frecuencia. Cubra las placas del pozo con una tapa y congele a 20 grados centígrados negativos durante la noche. Prepare las placas para el liofilizador quitando las tapas y asegurando la parte superior con toallitas y bandas de goma.
Coloque las placas en el tubo liofilizador y colóquelas durante 72 horas. Después de 72 horas, retire la placa del liofilizador. Los andamios ya están listos para ser utilizados para la transducción.
Si no utiliza los andamios inmediatamente, selle la placa con Parafilm y guárdela a cuatro grados centígrados hasta que sea necesario. Para el almacenamiento a largo plazo, se recomienda sellar al vacío la placa además de sellar con Parafilm. Concentrar sobrenadante viral centrifugando dos mililitros de solución viral a través de un filtro centrífugo a 1, 500 g durante 10 minutos.
Se necesitan de 100 a 200 microlitros de virus concentrado por andamio. Girar durante unos minutos adicionales si el volumen de la solución de virus concentrada es superior a 200 microlitros. Para cada andamio, hacer una alícuota de 1 millón de células T activadas suspendidas en 50 microlitros de medios de cultivo celular completos.
Agregue el virus concentrado a la suspensión celular. El volumen total de la suspensión del virus celular no debe exceder los 200 microlitros para un andamio de 48 pocillos, o 350 microlitros para un andamio de 24 pocillos. Agregue la mezcla de virus celular gota a gota a la parte superior del andamio seco.
Para experimentos de control negativo, utilice medios de cultivo celular completos en lugar de virus concentrados. Agregue esta suspensión celular a la parte superior del andamio seco. Incubar los andamios en la incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados durante 45 a 60 minutos.
Retire los andamios de la incubadora. Los andamios deben absorber completamente la solución durante este tiempo. Para inducir la proliferación, agregue medios de cultivo celular completos suplementados con IL-7 e IL-15 a cada pocillo.
También se puede utilizar IL-2. Para un andamio de 24 pocillos, agregue un mililitro. Para un andamio de 48 pocillos, agregue 500 microlitros.
Incubar a 37 grados centígrados durante 72 horas. Las células proliferarán durante las 72 horas, lo que puede hacer que los medios se vuelvan naranjas. Retire el exceso de medios de cada pocillo.
Para aislar las células del andamio, agregue 0,25 molares de solución EDTA a cada andamio. Agregue un mililitro para andamios de 24 pocillos o 300 microlitros para andamios de 48 pocillos. Deje que el plato se asiente o agite suavemente durante tres o cuatro minutos.
Una vez que se disuelva en su mayoría, pipetear hacia adentro y hacia afuera suavemente dentro del pozo. Es posible que se necesiten algunos pasos de pipeteo de entrada y salida para disolver completamente el andamio. Transfiera la solución a un tubo de centrífuga de 15 mililitros.
Lave las células dos veces con PBS. Agregue 12 mililitros de PBS a cada tubo de centrífuga. Centrifugar a 400 g durante cinco minutos.
Se formará un pellet celular en el fondo del tubo. Aspire la solución sobrenadante y repita el lavado. Tenga cuidado de eliminar completamente el sobrenadante con cada lavado, ya que es crucial deshacerse de todo el EDTA.
Después de lavar con PBS por segunda vez, el pellet celular está listo para su análisis. Se utilizó citometría de flujo para determinar la eficiencia de transducción de cada grupo. Las células no transducidas se utilizaron como control negativo y no mostraron transducción.
Las células sembradas en andamios sin retrovirus GFP tampoco mostraron transducción. El grupo Drydux, que tenía células activadas sembradas en los andamios secos de alginato macroporoso, mostró una transducción del 85%, justo más baja que el grupo RetroNectin. Estos resultados demuestran que los andamios Drydux transducen eficazmente las células mediante la transferencia de genes retrovirales sin la necesidad de espinoculación de placas recubiertas con RetroNectin.
Los andamios Drydux exhiben una alta eficiencia de transducción comparable a RetroNectin, proporcionando un método alternativo para transducir células T. Debido al bajo costo de fabricación de los andamios Drydux, este proceso tiene el potencial de reducir significativamente el costo de las terapias de células T con CAR.
