该协议为研究选择性血管屏障（如血视网膜或血脑屏障）的功能和通透性提供了一个有用的基于细胞的模型，特别关注内皮转吞作用。该测定易于设置和使用，无需活体动物。它可用于研究影响内部血视网膜屏障完整性的内皮细胞通透性和转吞作用的各种分子调节剂。
该测定可以为血管生物学以及眼睛和大脑研究提供见解，从而更好地了解BRB BBB控制的分子机制，并探索跨越屏障的潜在药物递送。首先，通过在层流罩下用200微升0.1%明胶溶液涂覆每个插入物30分钟，准备用于接种人视网膜微血管内皮细胞或HRMEC的细胞培养过滤器插入物。确保溶液覆盖过滤器插件的整个底面。
取一个培养皿，培养的HRMEC在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育，并吸出生长培养基。在层流罩下用10毫升1X PBS轻轻冲洗细胞两次，以去除潜在的漂浮或死细胞。用0.5至1毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液解离细胞，并将培养皿置于37摄氏度和5%二氧化碳的培养箱中5分钟。
通过加入4.5至9毫升生长培养基来淬灭胰蛋白酶活性，并使用10毫升移液管将细胞悬液转移到15毫升管中。在室温下以200倍g离心细胞5分钟。小心地除去上清液并将沉淀重悬于3毫升生长培养基中。
使用手动血细胞计数器或自动细胞计数器和接种，每个滤芯的密度为40， 000个细胞，计数细胞数量。每个插入物的细胞悬液体积为250微升。从含有渗透性插入物的孔中吸出涂层溶液，每个插入物转移250微升细胞悬液，然后仅向其中一个插入物中加入培养基，该插入物将用作跨内皮电阻或TEER测量的空白对照。
同时，在基底外侧室中每孔添加750微升培养基。将带有渗透性插入物的 24 孔板在培养箱中以 37 摄氏度和 5% 二氧化碳保持 7 至 12 天，直到培养的细胞完全融合并达到所需的 TEER 值约为每平方厘米 20 欧姆。在TEER测量之前，将含有细胞的24孔板在室温下置于层流罩中15至20分钟以进行温度平衡。
为了测量HRMEC的TEER，使用上皮伏特/欧姆表电阻系统，将电极连接到仪表，并通过首先将其浸泡在70%乙醇中15至20分钟，然后将其短暂浸入细胞培养EGM生长培养基中来平衡电极。通过小心地浸入电极来执行TEER测量，使较短的尖端在插入物中，而较长的尖端接触孔的底部。首先测量空白对照的电阻，然后对于每个插入件，一式三份测量TEER。
在达到TEER值约20欧姆平方厘米的汇合度时，在用配体处理之前，在两个腔室的EBM中使用0.5%FBS在37摄氏度和5%二氧化碳下剥夺细胞24小时。在整个测定过程中使用血清减少的EBM。在顶端室中使用血清还原培养基将细胞与荧光花青-3-标签一起孵育至转铁蛋白配体，在37摄氏度下孵育60分钟。
用血清还原培养基顶端和基底侧洗涤单层4次后，将新鲜培养基添加到含有细胞的滤芯中，并将插入物转移到含有预热的血清还原培养基的24孔板的新鲜孔中。将细胞在培养箱中再孵育90分钟，然后从基底外侧室收集培养基。使用荧光检测器记录来自基底外侧室的溶液的荧光强度。
在达到TEER值约20欧姆平方厘米的汇合度时，在用配体处理之前，在两个腔室的EBM中使用0.5%FBS在37摄氏度和5%二氧化碳下剥夺细胞24小时。在整个测定过程中使用血清减少的EBM。接下来，用所需的处理和载体对照处理顶室中的细胞。
向细胞中加入每毫升辣根过氧化物酶或HRP5毫克，并在37摄氏度下孵育15分钟。将新鲜的减血清培养基添加到顶室中，并将插入物转移到含有预热培养基的新鲜孔中。将单层在培养箱中再孵育90分钟。
从基底外侧室收集培养基后，向收集的培养基中加入100微升HRP荧光过氧化物酶底物，并在室温下孵育10分钟。用100微升终止溶液停止反应，并使用荧光板读数器检测培养基中HRP底物反应产物的水平。在演示体外转吞测定之前，视网膜中内皮细胞转吞作用的可视化显示为背景信息。
在这里，光学显微镜图像显示了来自用DAB染色的3个月大的野生型小鼠视网膜切片的HRP填充血管腔。HRP通过眶后注射。在光学显微镜下，HRP填充的视网膜血管可被视为深棕色沉淀物。
透射电子显微镜超薄切片显示HRP填充的转吞血管，其中RMEC描绘了穿过内部血视网膜屏障的EC转吞作用。在这里，大囊泡可能反映巨松体和鲁米诺侧的红细胞。TeM图像显示RMEC内充满HRP的小转细胞囊泡，可能是洞穴囊泡。
CAV-1抗体和异凝集素B4的免疫组织化学染色显示CAV-1（视网膜血管中洞穴囊泡的标志物）在3个月大的野生型小鼠视网膜中的定位。此处显示了视网膜内皮细胞内免疫金标记的CAV-1的TeM图像，并显示了CAV-1阳性洞穴囊泡的放大图像。对于使用转铁蛋白在HRMEC中进行网格蛋白介导的EC转吞测定，在这里，荧光显微镜图像显示HRMEC内红色的内吞Cy3转铁蛋白，用蓝色DAPI染色。
对于使用HRP的洞穴介导的EC转吞作用，此处使用Wnt信号作为示例来证明该测定。最近发现Wnt信号传导调节洞穴介导的EC转吞作用。用Wnt途径激活剂Wnt3a条件培养基和重组Norrin处理细胞，有或没有Wnt信号抑制剂XAV939及其反应性对照。
Wnt激活剂降低了基于HRP的转胞作用水平，XAV939逆转了转胞作用。正确的TEER测量对于确定单层完整性至关重要。它受处理不当、温度波动、培养基、培养时间等各种因素的影响很大。
该测定可以修改为模拟体内条件的共培养或3D器官型培养系统。
