Bu protokol, endotel transsitozuna özel bir odaklanma ile kan-retinal veya kan-beyin bariyeri gibi seçici vasküler bariyerlerin işlevini ve geçirgenliğini incelemek için yararlı bir hücre bazlı model sağlar. Bu tahlilin kurulumu ve kullanımı canlı hayvan gerektirmeden kolaydır. Endotel hücre geçirgenliğinin ve iç kan-retinal bariyer bütünlüğünü etkileyen transsitozun çeşitli moleküler düzenleyicilerinin araştırılmasında kullanılabilir.
Bu tahlil, vasküler biyoloji ve göz ve beyin araştırmaları hakkında fikir verebilir, BRB BBB kontrolünün altında yatan molekül mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasını ve bariyerler boyunca potansiyel ilaç dağıtımının araştırılmasını sağlar. Başlamak için, insan retinal mikrovasküler endotel hücrelerini veya HRMEC'leri tohumlamak için hücre kültürü filtre eklerini hazırlayın, her bir eki laminer bir akış başlığı altında 30 dakika boyunca 200 mikrolitre% 0.1 jelatin çözeltisi ile kaplayın. Çözeltinin filtre ekinin tüm alt yüzeyini kapladığından emin olun.
37 santigrat derecede inkübe edilmiş kültürlü HRMEC'ler ve% 5 karbondioksit içeren bir Petri kabı alın ve büyüme ortamını aspire edin. Potansiyel yüzen veya ölü hücrelerden kurtulmak için hücreleri laminer akış başlığının altında 10 mililitre 1X PBS ile iki kez nazikçe durulayın. Hücreleri 0.5 ila 1 mililitre% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ile ayırın ve Petri kabını inkübatöre 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 5 dakika boyunca yerleştirin.
4,5 ila 9 mililitre büyüme ortamı ekleyerek tripsin aktivitesini söndürün ve hücre süspansiyonunu 10 mililitrelik bir pipet kullanarak 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 kez g'de döndürün. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve peleti 3 mililitre büyüme ortamında yeniden askıya alın.
Manuel bir hemositometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre sayısını sayın ve filtre eki başına 40.000 hücre yoğunluğunda tohumlayın. Her bir kesici uç için hücre süspansiyonunun hacmi 250 mikrolitredir. Kaplama çözeltisini geçirgen kesici uçlar içeren kuyucuklardan aspire edin ve kesici uç başına 250 mikrolitre hücre süspansiyonu aktarın, ardından kesici uçlardan birine sadece orta ekleyin, bu da transendotelyal elektrik direnci veya TEER ölçümü için boş bir kontrol olarak kullanılacaktır.
Aynı zamanda, bazolateral odalarda kuyu başına 750 mikrolitre ortam ekleyin. Kültürlenmiş hücreler tamamen kaynaşana ve santimetre kare başına yaklaşık 20 ohm istenen TEER değerine ulaşılana kadar inkübatörde geçirgen uçlu 24 delikli plakayı 7 ila 12 gün boyunca 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte tutun. TEER ölçümlerinden önce, hücre içeren 24 delikli plakayı, sıcaklık dengesi için oda sıcaklığında laminer akış başlığına 15 ila 20 dakika boyunca yerleştirin.
HRMEC'ler için TEER'yi ölçmek için, bir epitel volt / ohm metre elektrik direnci sistemi kullanarak, elektrodu metreye bağlayın ve elektrodu önce 15 ila 20 dakika boyunca% 70 etanol içine batırarak ve daha sonra hücre kültürü EGM büyüme ortamına kısaca batırarak dengeleyin. Elektrotu dikkatlice daldırarak TEER ölçümü yapın, böylece kısa uç kesici uçta olur ve uzun uç kuyucuğun dibine temas eder. Önce boş kontrol boyunca direnci ölçün, ardından her kesici uç için TEER'yi üçlü olarak ölçün.
20 ohm santimetrekare civarında TEER değerleri ile akıcılığa ulaştıktan sonra, ligand ile tedaviden önce her iki odada EBM'de% 0.5 FBS kullanarak, hücreleri 37 santigrat derecede 24 saat ve% 5 karbondioksit kullanarak% 5 karbondioksitten mahrum bırakın. Serum azaltılmış EBM tahlil boyunca kullanıldı. Apikal odadaki serum indirgenmiş ortamı kullanarak hücreleri, floresan siyanin-3 etiketli olarak, 37 santigrat derecede 60 dakika boyunca transferrin ligandına kadar inkübe edin.
Tek katmanı apikal ve bazolateral olarak serum indirgenmiş ortam ile 4 kez yıkadıktan sonra, hücreleri içeren filtre uçlarına taze ortam ekleyin ve ekleri önceden ısıtılmış serum indirgenmiş ortam içeren 24 delikli plakanın taze kuyucuklarına aktarın. Hücreleri inkübatörde 90 dakika daha inkübe edin ve daha sonra ortamı bazolateral odadan toplayın. Bir floresan dedektörü kullanarak çözeltinin floresan yoğunluğunu bazolateral odadan kaydedin.
20 ohm santimetrekare civarında TEER değerleri ile akıcılığa ulaştıktan sonra, ligand ile tedaviden önce her iki odadaki EBM'de% 0.5 FBS kullanarak, hücreleri 37 santigrat derecede 24 saat ve% 5 karbondioksit kullanarak% 5 karbondioksitten mahrum bırakın. Serum azaltılmış EBM tahlil boyunca kullanıldı. Daha sonra, apikal odadaki hücreleri istenen tedaviler ve araç kontrolleri ile tedavi edin.
Hücrelere mililitre yaban turpu peroksidaz veya HRP başına 5 miligram ekleyin ve 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Apikal hazneye taze serum azaltılmış ortam ekleyin ve kesici uçları önceden ısıtılmış ortam içeren taze bir kuyuya aktarın. Tek katmanı inkübatörde 90 dakika daha inkübe edin.
Bazolateral odadan ortam topladıktan sonra, toplanan ortama 100 mikrolitre HRP florojenik peroksidaz substratı ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. 100 mikrolitre durdurma çözeltisi ile reaksiyonu durdurun ve bir floresan plaka okuyucu kullanarak ortamdaki HRP substrat reaksiyon ürününün seviyelerini tespit edin. İn vitro transsitoz tahlilleri gösterilmeden önce, retinadaki endotel hücre transsitozunun görüntülenmesi arka plan bilgisi olarak gösterilir.
Burada, ışık mikroskobu görüntüsü, DAB ile boyanmış 3 aylık vahşi tip bir fare retina bölümünden HRP dolu bir kan damarı lümenini göstermektedir. HRP retro-orbital olarak enjekte edildi. HRP dolgulu retinal damarlar, ışık mikroskobu altında koyu kahverengi çökelti olarak görülebilir.
Transmisyon elektron mikroskobu ultra ince kesit, iç kan-retinal bariyer boyunca EC transsitozunu gösteren RMEC'li HRP dolgulu transsitotik damarları gösterir. Burada, büyük vezikül potansiyel olarak makropinozomu ve luminol tarafındaki kırmızı kan hücresini yansıtır. TeM görüntüsü, RMEK içinde HRP dolu küçük transsitotik vezikülleri, muhtemelen caveola veziküllerini göstermektedir.
CAV-1 antikoru ve izolektin B4'ün immünohistokimya boyaması, 3 aylık vahşi tip fare retinasında, retinal kan damarlarında caveola veziküllerinin bir belirteci olan CAV-1'in lokalizasyonunu göstermektedir. Retinal endotel hücreleri içindeki immünoaltın etiketli CAV-1'in TeM görüntüsü, CAV-1 pozitif caveola vezikülünün büyütülmüş bir görüntüsü ile burada gösterilmiştir. Transferrin kullanan HRMEC'lerde klatrin aracılı EC transsitoz testi için, burada, bir floresan mikroskobu görüntüsü, mavi renkte DAPI ile boyanmış HRMEC'ler içinde kırmızı renkte endositozlu Cy3 transferrini göstermektedir.
HRP kullanan kaveola aracılı EC transsitozu için, buradaki Wnt sinyalizasyonu testi göstermek için örnek olarak kullanılmıştır. Wnt sinyalizasyonunun son zamanlarda kaveola aracılı EC transsitozunu düzenlediği bulunmuştur. Hücreler, Wnt sinyal inhibitörü XAV939 ve reaktif kontrolleri olan veya olmayan Wnt yol aktivatörü Wnt3a şartlı ortam ve rekombinant Norrin ile tedavi edildi.
Wnt aktivatörleri, XAV939 tarafından tersine çevrilen HRP bazlı transsitoz seviyesini düşürdü. Tek katmanlı bütünlüğü belirlemek için doğru TEER ölçümü çok önemlidir. Yanlış kullanım, sıcaklık dalgalanmaları, kültür ortamı, kültür süresi vb. gibi çeşitli faktörlerden büyük ölçüde etkilenir.
Bu test, in vivo koşulları taklit eden ko-kültür veya 3D organotipik kültür sistemleri olarak değiştirilebilir.
